唐 苗，余萬鑫，吳桃清，馬秀英，劉 衡,3，張成桂,3，白 麗,3，肖 懷,3

(大理大學(xué) 1. 昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室、2. 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心、3. 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000；4. 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團，四川 成都 610000)

美洲大蠊(Periplanetaamericana)俗稱“蟑螂”，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊科昆蟲，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，謂“味咸寒；主血瘀，癥堅，寒熱，破積聚，喉咽痹，內(nèi)寒，無子”[1]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有抗癌、抗腫瘤、抗纖維化、抗菌、抗炎、消腫止痛、組織修復(fù)、黏膜保護等功效[2]。近年來筆者所在的團隊研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊對腫瘤細胞及荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用明顯[3]，因此推測美洲大蠊主要是通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)而發(fā)揮抗癌、抗炎等作用的。結(jié)合前期研究，采取水提醇沉新工藝從美洲大蠊中提取所得的具有抗免疫性疾病潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的活性部位Ento-A[4-5]，以研究其對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為后續(xù)研究Ento-A免疫調(diào)控機制及開發(fā)抗UC新藥提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物SPF級昆明小鼠60只，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由湖南景萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。

1.2藥品美洲大蠊提取物Ento-A(云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室提供，批號：20140615)；黃芪多糖注射液(河南復(fù)興動物藥業(yè)有限公司，批號：20160624)；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，0.2 g，批號：16070425)。

1.3試劑都氏試劑(批號：SLBQ0489V)、ConA(Lot：SLBN5209V)購自Sigma公司；RPMI 1640、胎牛血清(Gibco公司)；MTT、中性紅、二甲基亞砜(DMSO)，均購自Solarbio公司；小鼠淋巴細胞分離液(深圳市達科為生物工程有限公司)；豚鼠血清、綿羊血由大理大學(xué)動物實驗中心提供。

1.4儀器Gen5型酶標分析儀(基因有限公司)；XFA6000全自動動物血細胞分析儀(南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用有限公司)；5510型CO2培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)；CKX41型倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組及給藥將60只昆明小鼠，隨機分為6組：空白對照組、模型對照組、陽性藥組(黃芪多糖注射液，160 mg·kg-1)、Ento-A高、中、低劑量組(400、200、100 mg·kg-1)。除空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組于給藥前連續(xù)腹腔注射80 mg·kg-1的環(huán)磷酰胺3 d，復(fù)制小鼠免疫抑制模型；空白對照組和模型對照組灌胃給予等量生理鹽水，其余各組給予相應(yīng)劑量藥物10 d；各組均于給藥d 1、3、5 注射體積分數(shù)為0.20的綿羊紅細胞(SRBC)0.2 mL致敏；并于造模小鼠給藥d 7 注射100 mg·kg-1環(huán)磷酰胺1次用于加強免疫，空白對照組按相同操作程序注射生理鹽水。

2.2外周血細胞測定末次給藥后1 h，小鼠摘眼球取血，取20 μL全血放入預(yù)稀釋液中，用動物血細胞分析儀以預(yù)稀釋模式測定外周血細胞。

2.3溶血素含量測定[6]末次給藥后1 h，小鼠摘眼球取血，2 000 r·min-1離心10 min，取血清，于56℃水浴30 min以滅活補體，對血清溶血素效價進行滴定。取血清稀釋相應(yīng)倍數(shù)，置于EP管內(nèi)，再加入0.5 mL 5%的綿羊紅細胞，1.0 mL稀釋的豚鼠血清，空白對照管內(nèi)用生理鹽水代替小鼠血清。將所有試管于37℃水浴鍋中恒溫10 min，取出放入冰浴中終止反應(yīng)；2 000 r·min-1離心10 min，取上清液1.0 mL，加都氏試劑3.0 mL于管內(nèi)；同時取5%的綿羊紅細胞0.25 mL，都氏試劑4.0 mL于另一支試管內(nèi)充分搖勻，放置10 min，以對照管做空白，于540 nm波長下，分別測量吸光度值，計算半數(shù)溶血值。半數(shù)溶血值公式為：HC50=(樣品吸光度值/SRBC半數(shù)溶血時的吸光度)×稀釋倍數(shù)。

2.4吞噬指數(shù)的測定[8-9]于末次給藥后1 h頸椎脫臼處死小鼠，放入體積分數(shù)為0.75的乙醇中浸泡3 min，腹腔注入4 mL無菌PBS緩沖液(含10%胎牛血清)，2 mL空氣，輕揉腹部3 min，無菌條件下打開腹腔，吸取腹腔液于離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清液收集巨噬細胞，PBS洗滌細胞2次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至5×109·L-1，以每孔100 μL接種于96孔板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后用PBS洗去未貼壁細胞，加入0.1%的中性紅溶液200 μL，孵育3 h。棄上清，洗滌細胞3次，每孔加入200 μL酸性乙醇溶解液(乙醇、乙酸等體積混合)，4℃靜置過夜，于520 nm波長下測定OD值，并計算吞噬率/%=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2.5臟器指數(shù)的測定取出小鼠脾臟和胸腺，去除脂肪和筋膜組織，稱取重量，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

2.6脾T淋巴細胞增殖實驗[6-7]取出小鼠的脾臟，制備脾臟細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×109·L-1，加入100 μL細胞懸液到96孔板中, 并加入ConA(終濃度為10 mg·L-1)刺激。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。每孔加20 μL MTT(5 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移去微孔中所有液體，再加入150 μL DMSO終止反應(yīng)，振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm處OD值。

2.7統(tǒng)計學(xué)方法以SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。兩兩比較經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊的實驗數(shù)據(jù)采用兩兩比較LSD法進行統(tǒng)計，方差不齊的實驗數(shù)據(jù)采用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1美洲大蠊提取物Ento-A對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響如Tab 1所示，注射環(huán)磷酰胺后，與空白對照組比較，模型對照組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.01)，提示造模成功；與模型對照組比較，各給藥組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所增加；Ento-A高、中、低劑量組脾臟指數(shù)明顯增加(P<0.01)，并呈良好劑量依賴性，胸腺指數(shù)呈劑量依賴性上升趨勢，其中高劑量組增加明顯(P<0.01)，見Fig 1、2。

Fig 1 Effect of Ento-A on spleen in mice

Fig 2 Effect of Ento-A on thymus in mice

GroupDose/mg·kg-1Spleenindex/mg·g-1Thymusindex/mg·g-1Control-3.84±0.682.93±0.70Model-2.30±0.44**1.11±0.30**Astragaluspolysaccha-rides1606.05±1.04**##1.25±0.34**Ento-Ahighdose4003.90±1.06##△△1.61±0.48**##Ento-Amiddledose2003.75±1.01##△△1.50±0.73**Ento-Alowdose1003.51±0.41##△△1.22±0.32**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsAstragalus polysaccharides

3.2美洲大蠊提取物Ento-A對免疫低下小鼠外周血細胞的影響Tab 2結(jié)果顯示，注射環(huán)磷酰胺后，與空白對照組比較，模型對照組的WBC、RBC、PLT、HGB水平均明顯降低(P<0.01)；經(jīng)藥物治療后，與模型對照組比較，各給藥組外周血細胞水平均有所升高；Ento-A各組呈一定劑量依賴性，其中WBC、PLT、HGB均已升高或超過正常水平，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3美洲大蠊提取物Ento-A對腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Tab 3結(jié)果顯示，模型對照組吞噬能力和吞噬率較正常對照組明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，各給藥組吞噬能力和吞噬率均明顯提高(P<0.01)；Ento-A各劑量組吞噬能力和吞噬率呈良好的劑量依賴性，其中高劑量組與陽性藥黃芪多糖作用相當(P>0.05)。

3.4美洲大蠊提取物Ento-A對血清溶血素含量的影響Tab 4結(jié)果顯示，模型對照組溶血素生成水平(HC50)較空白對照組明顯降低(P<0.01)，說明成功構(gòu)建免疫抑制模型。與模型對照組比較，各給藥組溶血素生成水平均明顯增強(P<0.01)；與黃芪多糖組比較，Ento-A高、中劑量組溶血素生成水平明顯提高(P<0.01)，且HC50呈一定的劑量依賴性。

3.5美洲大蠊提取物Ento-A對脾T淋巴細胞增殖的影響與空白對照組比較，模型對照組T淋巴細胞增殖明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，黃芪多糖組及Ento-A高、中、低劑量組T淋巴細胞增殖明顯增強(P<0.01)，其中Ento-A高、中劑量組與黃芪多糖組相當(P>0.05)，高劑量組已基本接近空白對照組(P>0.05)，見Tab 4。

4 討論

免疫反應(yīng)可分為非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。非特異性免疫又稱固有免疫，并協(xié)同、參與特異性免疫反應(yīng)。特異性免疫反應(yīng)分為抗體介導(dǎo)的體液免疫和T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫。免疫調(diào)節(jié)是指免疫系統(tǒng)中的免疫細胞、免疫分子及與其它系統(tǒng)之間的相互作用。免疫抑制能引發(fā)多種疾病，而免疫調(diào)節(jié)藥物能使得機體的免疫應(yīng)答維持在正常水平，構(gòu)建免疫抑制的動物模型可用來評價藥物的免疫調(diào)節(jié)作用[10]。采用注射環(huán)磷酰胺造成免疫抑制模型，從非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫3個方面考察Ento-A對小鼠免疫功能的影響。

脾臟和胸腺是重要的免疫器官，脾臟和胸腺的重量可以反映非特異性免疫的功能[11-12]。巨噬細胞是非特異性免疫反應(yīng)中的重要免疫細胞，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與特異性免疫的專職抗原提呈細胞，具有吞噬、殺傷、調(diào)控機體免疫等多種功能，是非特異性免疫的指標之一[11-12]。在環(huán)磷酰胺作用下，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅細胞的能力明顯降低，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯降低，固有免疫受到抑制，而給藥后，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、吞噬作用呈劑量依賴增加，提示美洲大蠊提取物Ento-A可能有改善免疫抑制小鼠固有免疫的功能。

Tab 2 Effects of Ento-A on blood cells in immunosuppressed mice(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsAstragalus polysaccharides

Tab 3 Effects of Ento-A on phagocytosis of peritoneal macrophages(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsAstragalus polysaccharides

Tab 4 Effects of Ento-A on production level of hemolyticin and T lymphocyte proliferation(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsAstragalus polysaccharides

T淋巴細胞等免疫細胞增殖是機體正常免疫應(yīng)答的前提與保證，研究T淋巴細胞體外增殖能力是研究細胞免疫的重要手段[13]。在環(huán)磷酰胺的作用下，小鼠脾臟T淋巴細胞增殖受到抑制。而給予美洲大蠊提取物Ento-A后，可以明顯促進脾臟T淋巴細胞體外增殖，提示 Ento-A可以改善免疫抑制小鼠細胞免疫功能。機體外周血細胞數(shù)量的變化可反映機體的免疫功能改變，而環(huán)磷酰胺不良反應(yīng)可導(dǎo)致血小板和白細胞的減少[14]。美洲大蠊提取物Ento-A可升高免疫抑制小鼠WBC、RBC、PLT、HGB等血常規(guī)指標，提示Ento-A可以改善小鼠免疫功能低下引起的血細胞數(shù)量減少。血清溶血素是B淋巴細胞受抗原刺激后產(chǎn)生的抗體，是評價體液免疫的重要指標[11]。Ento-A可以提高免疫抑制小鼠溶血素生成水平，具有提高免疫抑制小鼠體液免疫的功能。

本研究結(jié)果提示，美洲大蠊提取物Ento-A對免疫低下小鼠免疫功能具有增強作用，但其具體免疫機制還有待進一步研究。

(致謝：本實驗在大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室完成，感謝實驗室的老師和同學(xué)對實驗的指導(dǎo)和幫助。感謝大理大學(xué)實驗動物中心吳定宇老師，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生常旭、歐紅利的支持！)

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