柴玉娜，唐洪梅，黃育生，秦崇臻

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405)

內(nèi)臟高敏感性是腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with diarrhea, IBS-D)的主要病理特征，具體機(jī)制涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)，但確切機(jī)制至今尚無定論。近年來研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞因子/酪氨酸激酶受體(stem cell factor-C-kit，SCF/C-kit)系統(tǒng)在疼痛感知、胃腸動力紊亂和免疫炎癥異常激活中均有重要作用，可能與IBS-D內(nèi)臟高敏感性有關(guān)[1]，但相關(guān)報道目前尚不充分。已知免疫系統(tǒng)作為IBS-D精神-腸道因素互動的關(guān)鍵紐帶，其平衡對IBS-D內(nèi)臟敏感性有重要影響。本研究通過觀察SCF/C-kit系統(tǒng)在IBS-D中的變化及其與IBS-D免疫功能紊亂的關(guān)系，旨在進(jìn)一步探索IBS-D內(nèi)臟高敏感發(fā)生的機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物新生SD大鼠窩鼠，SPF級，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號SCXK(粵)：2013-0034。飼養(yǎng)員協(xié)助剔除♀乳鼠，得♂乳鼠，與哺乳母鼠同窩飼養(yǎng)。哺乳母鼠自由進(jìn)食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18℃～24℃，相對濕度50%～70%。

1.2試劑總RNA提取試劑盒(批號AK501)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號AK3101)、SYBR染料(批號AK6004)，均購自日本TaKaRa公司；引物(Invitrogen公司)；SCF一抗(Abcam，批號：AB101072)；C-kit一抗(Thermofisher，批號：PA5-16770)；二抗試劑盒(北京博奧森，批號SP0023)；EDTA抗原修復(fù)液(福州邁新，批號：MVS-009810099)；DAB顯色液(康為世紀(jì)，批號CW0125)。

1.3儀器熒光定量PCR儀器(美國Bio Rad，型號CFX96)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司，型號1510)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，型號TH4-200)。

2 方法

2.1動物模型的制備及評估按照文獻(xiàn)方法，采用三因素法(母嬰分離、醋酸刺激、束縛應(yīng)激)制備肝郁脾虛IBS-D大鼠模型[2]。造模結(jié)束后，參照文獻(xiàn)用腹部回縮反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)方法進(jìn)行模型的評估：將10F雙腔導(dǎo)尿管涂抹潤滑油后，小心插入大鼠肛門8 cm(預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)，用膠帶綁好，放入自制的玻璃盒中，任其自由活動，適應(yīng)環(huán)境。等大鼠安靜后，用注射器向管腔內(nèi)分別注入0.5、1、1.5 mL水，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)評估后，選用1.5 mL作為正式實(shí)驗(yàn)注水量，觀察大鼠5 min內(nèi)的活動情況(Fig 1)，并進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評分。

2.2樣本獲取評估結(jié)束后，按照0.4 g ·kg-1劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。腹主動脈采血，離心后取上層血清，-80℃保存；迅速截取遠(yuǎn)端結(jié)腸2 cm，分成兩份，分別用于免疫組化和PCR檢測。

Fig 1 Valuation of visceral sensitivity by abdominal withdrawal reflex

2.3免疫組化法觀察結(jié)腸SCF及C-kit的原位表達(dá)各組取白片6張，烤片20 min；二甲苯(To生物制片透明劑代替)，10 min×2次；梯度乙醇脫蠟至水；置于H2O2室溫20 min；枸櫞酸修復(fù)后加5% BSA封閉液，室溫20 min；滴加一抗，37℃ 1 h； PBS洗后滴加二抗，室溫 20 mim； PBS 2 min×3次；滴加SABC，室溫20 mim；PBS洗后DAB顯色，顯色4～8 min后自來水洗；無水乙醇梯度脫水后風(fēng)機(jī)吹干，封片。顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)棕色者為陽性表達(dá)，無著色則為陰性表達(dá)。

2.4qPCR法檢測結(jié)腸中SCF、C-kitmRNA的表達(dá)稱取100 mg結(jié)腸組織，加液氮研成細(xì)粉。加入TaKaRa Mini BEST Universal Genomic RNA Extraction Kit 裂解液充分裂解，用70%乙醇沉淀，后轉(zhuǎn)入RNA 吸附柱，12 000 r·min-1，離心1 min，用試劑盒中洗液充分洗滌柱子后，用無RNA酶水洗脫RNA。用微量核酸測定儀檢測吸光度值，以260 nm/280 nm比值在1.8～2.2為標(biāo)準(zhǔn)，控制RNA的純度，用瓊脂糖橫向電泳檢測總RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列見Tab 1。采用以下逆轉(zhuǎn)錄體系：37℃ 15 min，85℃ 5 s。擴(kuò)增反應(yīng)：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果用CT值表示，以β-actin為內(nèi)參照，通過2-△△CT法計(jì)算相對表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequence of C-kit, SCF and β-actin

2.5SCF、C-kit與免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離胸腺、脾臟，計(jì)算胸腺系數(shù)和脾系數(shù)，雙抗體夾心ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-8、IL-10的表達(dá)[3]。分析SCF、C-kit與免疫指標(biāo)的相關(guān)性，用單樣本K-S檢驗(yàn)分析各指標(biāo)數(shù)據(jù)的正態(tài)性；對于符合雙變量正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料，采用積矩相關(guān)系數(shù)(Pearson相關(guān)系數(shù))；對于非雙變量正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料，選用等級相關(guān)系數(shù)(Spearman相關(guān)系數(shù))。

3 結(jié)果

3.1SCF及C-kit的原位表達(dá)顯微鏡下觀察結(jié)腸中SCF和C-kit蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)棕色者為陽性表達(dá)，無著色則為陰性表達(dá)。Fig 2、3結(jié)果表明，SCF和C-kit蛋白在肌層、黏膜層、黏膜下層均有不同程度的表達(dá)。與正常組相比，模型組大鼠腸道肌層、黏膜層SCF和C-kit蛋白的陽性表達(dá)減弱。每張切片取5個區(qū)域拍照，隨機(jī)選取1張應(yīng)用IPP6.0病理圖像分析軟件測定免疫陽性產(chǎn)物的光密度值(OD值)，作為該樣本的OD值。Tab 2結(jié)果表明，與正常組相比，模型組的SCF和C-kit的蛋白表達(dá)量均明顯下降(P<0.01)。

Tab 2 Protein expressions of SCF and

#P<0.05,##P<0.01vsnormal

Fig 2 In situ expression of SCF in rat colon(×200)

A: Muscular layer in normal rat; B: Muscular layer in model rat; C: Mucous layer in normal rat; D: Mucous layer in model rat

Fig 3 In situ expression of C-kit in rat colon (×200)

A: Muscular layer in normal rat; B: Muscular layer in model rat; C: Mucous layer in normal rat; D: Mucous layer in model rat

3.2SCF、C-kit的mRNA表達(dá)Fig 4結(jié)果表明，與正常組相比，腸道SCF和C-kit的mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 Relative expressions of SCF and C-kit mRNA in rat colon

##P<0.01vsnormal

3.3SCF、C-kit的mRNA表達(dá)與IBS-D免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析IBS-D大鼠與正常組相比，胸腺系數(shù)、脾系數(shù)、TNF-α、IL-8、IL-10的表達(dá)數(shù)據(jù)另文發(fā)表[3]。如Tab 3所示，SCF的表達(dá)與脾系數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與TNF-α、IL-8呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，P<0.05)，與IL-10呈正相關(guān)(P<0.05)；C-kit的表達(dá)與胸腺系數(shù)和脾系數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，C-kit的表達(dá)與TNF-α呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

Tab 3 Correlation analysis between SCF-C-kit and immunity indicators

*P<0.05,**P<0.01

4 討論

SCF/C-kit是人類多種細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和凋亡的重要調(diào)控系統(tǒng)。C-kit受體是由原癌基因C-kit編碼的一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(intestinal Cajal interstitial cell，ICC)的特異性識別因子。SCF是C-kit的配體因子，同時又是肥大細(xì)胞生長的重要因子，在調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長發(fā)育中起著重要作用。SCF作用的發(fā)揮需要依賴其與C-kit的結(jié)合。SCF/C-kit的下游信號傳導(dǎo)通路主要包括Ras/ERK通路、PI3K通路、PLC-γ通路、Src激酶通路及JAK/STAT通路，這些均為機(jī)體的重要通路，其具體機(jī)制復(fù)雜。

ICC、肥大細(xì)胞(mast cell，MC)、神經(jīng)細(xì)胞及上皮細(xì)胞形成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)是IBS-D神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。SCF 與C-kit結(jié)合后形成二聚體復(fù)合物，引起細(xì)胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化及下游信號變化，從而對多種細(xì)胞的分裂、增殖產(chǎn)生影響，如ICC、MC、神經(jīng)細(xì)胞等[1,4]。

ICC是引起IBS腸道高敏感性和動力紊亂的起搏細(xì)胞，在IBS的發(fā)病中有重要作用[5]。研究認(rèn)為，與ICC膜表面的P物質(zhì)、5-HT等受體相關(guān)[6-7]，它們均參與IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。SCF調(diào)控肥大細(xì)胞的生存、黏附、脫顆粒、介質(zhì)釋放，發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)功能[8]。作為MC趨化因子，SCF能夠促進(jìn)它們從CD34+祖細(xì)胞中再生；在體外，SCF能夠誘導(dǎo)MC的生存和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，SCF/C-kit系統(tǒng)受到抑制會導(dǎo)致體內(nèi)組胺水平的明顯下降，從而減輕腸道黏膜的損傷及降低對痛覺的敏感性。而通過C-kit抗體干預(yù)SCF/C-kit通路能夠減緩MC的分化，進(jìn)而緩解炎癥。SCF/C-kit被認(rèn)為是炎癥發(fā)生時控制MC的潛在作用靶點(diǎn)之一[8-9]。SCF/C-kit系統(tǒng)不僅具有維持神經(jīng)嵴細(xì)胞存活、增殖、營養(yǎng)的作用，并且能夠誘導(dǎo)神經(jīng)嵴向感覺神經(jīng)元的分化。C-kit主要存在于有絲分裂后的神經(jīng)細(xì)胞中，這些細(xì)胞處于向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化的早期階段。SCF則沿基板分布于丘腦和嗅上皮，提示這一配基-受體系統(tǒng)參與了發(fā)育中腦背-腹側(cè)的形成。研究表明SCF能夠刺激神經(jīng)再生，且和機(jī)體的精神狀態(tài)相關(guān)[10]，提示干預(yù)SCF極有可能影響神經(jīng)功能傳輸，進(jìn)而影響到疼痛感知。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SCF/C-kit信號對腸道上皮屏細(xì)胞的生物學(xué)功能也有調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)上皮(intestinal epithelial cell，IECs)細(xì)胞向纖維蛋白黏附[11]，從而加強(qiáng)屏障功能。

SCF/C-kit信號在腸道動力、內(nèi)臟感知、過敏及免疫中的作用均有報道，但是在IBS-D中的報道較為少見。國內(nèi)有報道，內(nèi)臟高敏感性大鼠腸道肌層ICC升高[12-13]，結(jié)合本研究中模型組的IBS-D大鼠SCF/C-kit降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測，由于SCF/C-kit在肌層、黏膜固有層及上皮層等廣泛存在，某局部位置ICC的變化可能不能夠完全反映SCF/C-kit信號的變化。本研究所采用標(biāo)本是結(jié)腸的整體組織標(biāo)本，即對肌層、黏膜層等的整體影響，提示SCF/C-kit信號的變化在不同的部位如黏膜固有層、上皮層等可能有差異。另外本實(shí)驗(yàn)采用的造模方法是三因素結(jié)合的方法制備IBD-D大鼠模型，模型制備方法也可能是SCF/C-kit信號變化的影響因素。

我們前期研究表明，三因素法制備的IBS-D大鼠出現(xiàn)免疫系統(tǒng)異常[3]，包括胸腺系數(shù)、IL-10降低，TNF-α以及IL-8的表達(dá)升高。本研究進(jìn)一步通過相關(guān)性分析表明，這些免疫指標(biāo)的異常與SCF/C-kit有關(guān)，進(jìn)一步闡釋了IBS-D內(nèi)臟高敏感發(fā)生的機(jī)制。

SCF/C-kit系統(tǒng)影響范圍較廣，機(jī)制相對復(fù)雜，其對多種靶細(xì)胞分別有怎樣的調(diào)控途徑，也還有待進(jìn)一步深入研究。目前，該信號在IBS-D中的研究尚多限于ICC范疇，深入探討其多層面的變化，對于探索IBS-D內(nèi)臟高敏感的發(fā)生有實(shí)際意義。

[致謝：本實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)(免疫)實(shí)驗(yàn)室共同完成，感謝參與實(shí)驗(yàn)的老師和同學(xué)。]

[1] Chai Y, Huang Y, Tang H, et al. Role of stem cell growth factor/c-Kit in the pathogenesis of irritable bowel syndrome[J].ExpTherMed, 2017,13(4): 1187-93.

[2] 唐洪梅, 房財富, 廖小紅,等. 神經(jīng)肽Y和5-羥色胺在腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠中表達(dá)的研究[J].中國藥理學(xué)通報, 2012,28(7): 916-20.

[2] Tang H M, Fang C F, Liao X H, et al. Expression of NPY and 5-HT in rat model of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome [J].ChinPharmacolBull, 2012,28(7): 916-20.

[3] 柴玉娜, 黃育生, 唐洪梅,等. 疏肝健脾法腸激安方對IBS-D大鼠免疫功能的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2016,22(21): 93-8.

[3] Chai Y N, Huang Y S, Tang H M, et al. Effect of Shugan Jianpi method ( Changji'an fomulation) on IBS-D immune function [J].ChinJExpTraditMedFormulae, 2016,22(21): 93-8.

[4] Liang J, Wu Y L, Chen B J, et al. The C-kit receptor-mediated signal transduction and tumor-related diseases[J].IntJBiolSci, 2013,9(5): 435-43.

[5] Eshraghian A, Eshraghian H. Interstitial cells of Cajal: a novel hypothesis for the pathophysiology of irritable bowel syndrome[J].CanJGastroenterol, 2011,25(5): 277-9.

[6] Ward S M, Sanders K M, Hirst G D. Role of interstitial cells of Cajal in neural control of gastrointestinal smooth muscles[J].NeurogastroenterolMotil, 2004,16(Suppl 1): 112-7.

[7] Kim M W, Jiao H Y, Kim S W, et al. Prostanoid EP3 receptor agonist sulprostone enhances pacemaker activity of colonic interstitial cells of Cajal[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol, 2017.

[8] Al-Azzam N, Kondeti V, Duah E, et al. Modulation of mast cell proliferative and inflammatory responses by leukotriene d4 and stem cell factor signaling interactions[J].JCellPhysiol, 2015,230(3):595-602.

[9] Cho K A, Park M, Kim Y H, et al. Th17 cell-mediated immune responses promote mast cell proliferation by triggering stem cell factor in keratinocytes[J].BiochemBiophysResCommun, 2017,487(4):856-61.

[10] Benedetti F, Poletti S, Hoogenboezem T A, et al. Stem cell factor (SCF) is a putative biomarker of antidepressant response[J].JNeuroimmunePharmacol, 2016,11(2):248-58.

[11] Jeong W, Jung S, Bazer F W, et al. Stem cell factor-induced AKT cell signaling pathway: effects on porcine trophectoderm and uterine luminal epithelial cells[J].GenCompEndocrinol, 2017,250:113-21.

[12] 潘 鋒, 張 濤, 陳建永.痛瀉要方對腹瀉型腸易激綜合征Cajal間質(zhì)細(xì)胞影響的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2009,27(6): 1272-3.

[12] Pan F, Zhang T, Chen J Y. The effect of TongxieYaofang decoction on Cajal cells in a rat model of D-IBS [J].ChinArchivesTraditChinMed, 2009,27(6): 1272-3.

[13] 丁瑞峰, 王愛魚, 王宏杰,等.內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞C-KIT表達(dá)增加[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012,32(5): 566-9.

[13] Ding R F, Wang A Y, Wang H J, et al. Increased expression of C-KIT in ICC in colon of rats with visceral hypersensitivity [J].BasicClinMed, 2012,32(5): 566-9.