孟 哲，李海禹，劉宇宙，陶海龍，李 凌

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是引起多種心腦血管病變的主要原因，預(yù)計(jì)到2020年，AS將成為世界首要致死原因[1]。新近研究顯示[2]，AS是一種炎癥性疾病，炎癥因子參與了AS的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是動(dòng)脈壁的重要組成部分，可以在包括內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)以內(nèi)的多種炎癥誘導(dǎo)因子刺激下，分泌大量炎癥因子、黏附分子及趨化因子，參與血管壁內(nèi)的炎癥反應(yīng)[3]。積雪草酸(asiatic acid，AA)是從雙子葉傘形科植物積雪草(Centellaasiatica)中萃取而來(lái)，屬于五環(huán)三萜酸植物多酚，其結(jié)構(gòu)如Fig 1所示?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，AA具有抗炎、抗增殖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[4]。AA可以通過(guò)下調(diào)TLR4表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)，還被證實(shí)具有一定的過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPAR-γ)激活作用[5]。然而，AA是否具有抗AS的心血管保護(hù)作用，目前尚未見報(bào)道。本文聚焦于AA能否抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并期望從Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)及PPAR-γ表達(dá)水平入手，進(jìn)一步闡明AA抗炎作用的分子機(jī)制。

Fig 1 Structural formula of asiatic acid

1 材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)♂ SD大鼠10只，6～8周，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(豫)2017-0096。

1.2試劑DMEM高糖培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：275639)；新鮮胎牛血清(北京TransGen公司,批號(hào):8131640); 積雪草酸標(biāo)準(zhǔn)品(廣西博科天然藥物有限公司,批號(hào):20170515,純度>96%)；PCR試劑盒(北京TransGen公司，批號(hào)：20170320)；0.25%的胰酶(美國(guó)Hyclone公司,批號(hào):271526)；LPS、青霉素、鏈霉素、GW9662、噻唑藍(lán)，均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；白細(xì)胞介素-6(interleukin, IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α) 試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R&D公司，批號(hào)分別為41230525、39270521、43720425；兔抗大鼠TLR4、PPAR-γ、Histone、β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為3354172、3927129、2765124、4125649；所有PCR引物和TLR4-siRNA由南京金思瑞生物有限公司合成。

1.3儀器超凈臺(tái)(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)發(fā)展有限公司)，MCO175型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，CS-15R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，IQ5熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

2 方法

2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)分離8～10周SD大鼠主動(dòng)脈，去除血管外膜和內(nèi)膜，充分剪碎至1～2 mm3大小組織塊。參照文獻(xiàn)[6]所述步驟，使用貼壁法培養(yǎng)VSMCs細(xì)胞。將細(xì)胞置于10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至 80%～90%時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法測(cè)定細(xì)胞活性“2.1”中細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h，2%的低血清培養(yǎng)基孵育12 h后，將細(xì)胞分為8組，分別采用0、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1AA及LPS(500 μg·L-1)干預(yù)24 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，37℃孵育4 h，棄去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，微微振蕩數(shù)次后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于570 nm 處測(cè)定各組吸光值。

2.3TLR-siRNA轉(zhuǎn)染VSMCs細(xì)胞將各組細(xì)胞以5×105個(gè)每孔的密度接種于6孔板中，待生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。將含有100 pmol siRNA的培養(yǎng)液400 μL和含有5 μg脂質(zhì)體Lip2000的培養(yǎng)液400 μL混合，充分混勻并靜置25 min。然后，將此轉(zhuǎn)染混合液加入充分漂洗后的6孔板內(nèi)，將6孔板置入培養(yǎng)箱中孵育6 h，用含10%胎牛血清、雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，確定轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4ELISA法測(cè)定MCP-1、TNF-α和IL-6水平將各組細(xì)胞以5×104個(gè)每孔的密度接種于96孔板中，待生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，換用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h。不同濃度AA(10、20、30 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，LPS(500 μg·L-1)刺激不同時(shí)間后，收集各組細(xì)胞上清液。依據(jù)操作說(shuō)明，使用ELISA試劑盒測(cè)定MCP-1、TNF-α、IL-6水平。使用自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附儀在450 nm處讀取數(shù)值，繪制MCP-1、TNF-α、IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依據(jù)此計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果。

2.5Real-timePCR法測(cè)定MCP-1、TNF-α、IL-6、TLR4、PPAR-γmRNA的表達(dá)將各組細(xì)胞以5×105個(gè)每孔的密度接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用不同濃度積雪草酸(10、20、30 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，再給予 LPS(500 μg·L-1)刺激6 h，按照說(shuō)明書使用TRIzol試劑提取各組總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計(jì)于260 nm處檢測(cè)RNA的純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將各組mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所采用的引物序列見Tab 1。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。使用熒光PCR儀自帶分析軟件對(duì)real-time PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

Tab 1 Prime sequence and PCR product length

2.6Westernblot法測(cè)定TLR4和PPAR-γ蛋白水平以5×105個(gè)每孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h后，用含不同濃度AA(10、20、30 μmol·L-1)或TLR4-siRNA、GW9662(10 μmol·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理2 h后，加入LPS(500 μg·L-1)刺激24 h。每孔使用200 μL RIPA裂解液提取蛋白。核內(nèi)PPAR-γ蛋白使用核蛋白提取試劑盒提取，并采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛葹門LR4(1 ∶400)、PPAR-γ(1 ∶500)、Histone(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)。以β-actin和Histone作為內(nèi)參照?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Quantity one軟件進(jìn)行圖像分析。

3 結(jié)果

3.1AA對(duì)VSMCs細(xì)胞活性的影響為排除AA可能的細(xì)胞毒性對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使用MTT法測(cè)定0～50 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)AA和500 μg·L-1的LPS對(duì)VSMCs細(xì)胞活性的影響。Fig 2結(jié)果顯示，當(dāng)AA濃度在0～30 μmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)VSMCs細(xì)胞活性無(wú)明顯影響(P>0.05)；當(dāng)給予細(xì)胞500 μg·L-1LPS刺激24 h，也未產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性(P>0.05)。故以下實(shí)驗(yàn)中，我們選擇10、20、30 μmol·L-13個(gè)濃度AA作為干預(yù)條件。

Fig 2 Effect of AA and LPS(500 μg·L-1) on VSMCs viability

##P<0.01vscontrol group

3.2AA對(duì)LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞MCP-1、TNF-α、IL-6mRNA和蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，當(dāng)給予VSMCs細(xì)胞500 μg·L-1LPS刺激24 h后，MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白水平明顯升高(P<0.05)；AA則能夠濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白合成增加。與之類似，AA亦能夠濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞MCP-1、TNF-α、IL-6 mRNA合成，當(dāng)VSMCs細(xì)胞與30 μmol·L-1的 AA孵育6、24 h，均不影響MCP-1、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)。

3.3AA通過(guò)下調(diào)TLR4表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞MCP-1、TNF-α、IL-6表達(dá)LPS通過(guò)與VSMCs表面的CD14結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)TLR4表達(dá)是誘發(fā)VSMCs細(xì)胞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)給予VSMCs細(xì)胞500 μg·L-1LPS刺激6、24 h后，TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯提高(P<0.05)。給予細(xì)胞不同濃度AA(10、20、30 μmol·L-1)預(yù)處理能有效抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞TLR4表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AA的抗炎作用與其對(duì)TLR4表達(dá)下調(diào)相關(guān)，我們使用TLR4-siRNA對(duì)TLR4進(jìn)行基因沉默。結(jié)果顯示，TLR4-siRNA能夠起到與AA類似的抗炎作用，而聯(lián)用TLR4-siRNA和AA(30 μmol·L-1)能夠進(jìn)一步降低炎癥因子合成。當(dāng)給予細(xì)胞30 μmol·L-1AA孵育6、24 h，并不影響TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)(Fig 4)。

3.4AA通過(guò)上調(diào)PPAR-γ表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞MCP-1、TNF-α、IL-6表達(dá)PPAR-γ是LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。如Fig 5所示，當(dāng)給予VSMCs細(xì)胞500 μg·L-1LPS刺激6、24 h后，PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。給予AA(10、20、30 μmol·L-1)預(yù)處理能有效抑制LPS誘導(dǎo)的PPAR-γ活性。當(dāng)僅給予VSMCs細(xì)胞30 μmol·L-1AA孵育6、24 h后，PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。為進(jìn)一步明確AA抗炎作用與

Fig 3 Effect of AA on LPS-induced mRNA and protein expression of IL-6(A), MCP-1(B) and TNF-α(C)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group

Fig 4 AA inhibited LPS-induced mRNA and protein expression of IL-6, MCP-1 and TNF-α partially dependent on down-regulating TLR4

A: Protein and mRNA expression of TLR4; B: Protein and mRNA expression of IL-6; C: Protein and mRNA expression of MCP-1; D: Protein and mRNA expression of TNF-α.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group;△P<0.05vsAA group.

Fig5AAinhibitedLPS-inducedmRNAandproteinexpressionofIL-6,MCP-1andTNF-αpartiallydependentonup-regulatingPPAR-γ

A: Protein and mRNA expression of PPAR-γ; B: Protein and mRNA expression of IL-6; C: Protein and mRNA expression of MCP-1; D: Protein and mRNA expression of TNF-α.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group;△P<0.05,△△P<0.01vsAA group.

其上調(diào)PPAR-γ活性相關(guān)，采用PPAR-γ拮抗劑GW9662對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果顯示，GW9662能夠部分拮抗AA的抗炎作用，提示AA抗炎作用與其上調(diào)PPAR-γ活性相關(guān)。

4 討論

近年來(lái)，長(zhǎng)期的低度炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣斑塊形成及失穩(wěn)過(guò)程中的作用越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界關(guān)注。病理性的炎癥反應(yīng)可能通過(guò)誘導(dǎo)VSMCs凋亡，加速動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，并使得穩(wěn)定性斑塊向易損性斑塊轉(zhuǎn)變，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展[7]。LPS是高效致炎因子，與受體結(jié)合后能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs、巨噬細(xì)胞等大量分泌炎癥介質(zhì)[8]。因此，抑制VSMCs細(xì)胞的炎癥反應(yīng)已成為延緩動(dòng)脈粥樣斑塊形成的重要治療靶點(diǎn)。

IL-6能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，增加淋巴因子合成，促進(jìn)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分泌功能的漿細(xì)胞，誘導(dǎo)大量特異性抗體生成，目前認(rèn)為，IL-6主要通過(guò)影響細(xì)胞免疫過(guò)程，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展[9]。MCP-1能夠誘導(dǎo)循環(huán)體系中的巨噬細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下區(qū)域，進(jìn)而加速斑塊脂質(zhì)核心形成速度[10]。TNF-α通過(guò)誘導(dǎo)斑塊區(qū)域VSMCs凋亡、觸發(fā)血小板黏附和聚集、巨噬細(xì)胞趨化和膽固醇沉積等途徑，加速動(dòng)脈粥硬化斑塊形成和斑塊不穩(wěn)定，且血清內(nèi)TNF-α水平和冠脈狹窄程度呈正相關(guān)關(guān)系[11-12]。因此，抑制IL-6、MCP-1和TNF-α水平病理性升高對(duì)減緩AS的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LPS能夠明顯誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA和蛋白合成。AA則能夠濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA和蛋白合成增加。據(jù)此，可以推測(cè)AA能夠一定程度抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

Toll樣受體家族成員眾多，參與到包括分子模式識(shí)別、抗原提呈和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種炎癥相關(guān)免疫應(yīng)答的多個(gè)環(huán)節(jié)，其中TLR4是Toll樣受體家族中的重要一員，也是LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，當(dāng)LPS與細(xì)胞膜表面的CD14結(jié)合后，使TLR4激活，進(jìn)而通過(guò)Myd88依賴的經(jīng)典途徑或者非經(jīng)典途徑，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)多種炎癥因子的釋放[13]。因此，抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4激活可能在抗AS,保護(hù)心血管中起到一定的作用。在本研究中，我們也將AA的抗炎作用聚焦在調(diào)節(jié)TLR4活性上。研究結(jié)果顯示，AA能夠減少LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)，并具有濃度依賴性。同時(shí)，使用TLR4-siRNA對(duì)TLR4進(jìn)行基因沉默，可以達(dá)到與AA相似的抗炎效果；兩者同時(shí)使用還可以進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)炎癥因子釋放的抑制作用。由此推測(cè)，AA對(duì)LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用可能與其對(duì)TLR4表達(dá)下調(diào)相關(guān)。

PPAR-γ是PPAR家族重要成員，活化后與RXR結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因表達(dá)。PPAR-γ已被多項(xiàng)研究證實(shí)廣泛參與到炎癥、細(xì)胞增殖、癌細(xì)胞侵襲過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)，且PPAR-γ廣泛分布于包括VSMCs在內(nèi)的多種心血管組織，具有抑制炎癥因子釋放和VSMCs及心臟成纖維細(xì)胞增殖的心血管保護(hù)作用[14]。之前的研究顯示，AA能夠通過(guò)上調(diào)PPAR-γ活性，抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)給予VSMCs細(xì)胞LPS刺激后，PPAR-γ的表達(dá)明顯降低；AA能夠濃度依賴性的拮抗LPS誘導(dǎo)的PPAR-γ表達(dá)減低。給予VSMCs細(xì)胞PPAR-γ拮抗劑GW9662預(yù)處理，能夠通過(guò)抑制PPAR-γ的激活，進(jìn)而部分抵消AA的抗炎效果。據(jù)此可知，AA具有一定的PPAR-γ激活作用，且這種作用參與了AA抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞炎癥反應(yīng)的生理過(guò)程。

綜上所述，AA能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞炎癥因子釋放，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4表達(dá)和上調(diào)PPAR-γ活性有關(guān)。

[1] 李紅蓉，秘紅英，孫 穎，等．內(nèi)皮間質(zhì)分化在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2017,10(33):1338-41.

[1] Li H R, Mi H Y, Sun Y, et al. Advances of endothelial stromal differentiation at atherosclerosis[J].ChinPharmacolBull, 2017,10(33):1338-41.

[2] 陳燕銘，熊肇軍，尹瓊麗，等．2型糖尿病患者血清炎癥因子和脂聯(lián)素水平與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系[J]．中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2011,19(10):842-6.

[2] Chen Y M, Xiong Z J, Yin Q L, et al. Relationship between serum inflammatory factors and adiponectin levels in patients with type 2 diabetes mellitus and atherosclerosis[J].ChinJArteriosclerosis, 2011,19(10):842-6.

[3] Chepelenko G V. Atherosclerosis regulation via media lipid-driven VSMC cholesterol efflux switch[J].MedHypotheses, 2015,84(2):141-4.

[4] 孟艷秋，張偉晨，寧梓廷，等．積雪草酸A環(huán)開環(huán)衍生物的合成及體外抗腫瘤活性研究[J]．中國(guó)新藥雜志，2017，26(10)：1157-61.

[4] Meng Y Q, Zhang W C, Ning X T, et al. Synthesis andinvitroantitumor activity of cycloacyclic A-ring ring-opening derivatives[J].ChinJNewDrugs, 2017，26(10)：1157-61.

[5] Hao C, Wu B, Hou Z, et al. Asiatic acid inhibits LPS-induced inflammatory response in human gingival fibroblasts.[J].IntImmunopharmacol, 2017, 9(50):313-8.

[6] 高 靜，朱紅霞，王敏哲，等．VEGF對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞株功能的影響及相關(guān)機(jī)制[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,6(35):3257-9.

[6] Gao J, Zhu H X, Wang M Z, et al. Effect of VEGF on the function of human vascular smooth muscle cell line and its related mechanisms[J].ChinJGerontol, 2015,6(35):3257-9.

[7] Pant S, Deshmukh A, Gurumurthy G S, et al. Inflammation and atherosclerosis-revisited[J].JCardiovascPharmacolTher, 2014,19(2):170-8.

[8] Li L, He M, Zhou L, et al. A solute carrier family 22 member 3 variant rs3088442 G→A associated with coronary heart disease inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response[J].JBiolChem, 2015,290(9):5328-40.

[9] Hartman J, Frishman W H. Inflammation and atherosclerosis: a review of the role of interleukin-6 in the development of atherosclerosis and the potential for targeted drug therapy[J].CardiolRev, 2014,22(3):147-51.

[10] Lin J, Kakkar V, Lu X. Impact of MCP-1 in atherosclerosis[J].CurrPharmDes. 2014,20(28):4580-8.

[11] Zhang Y, Yang X, Bian F. TNF-α promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells: crosstalk between NF-κB and PPAR-γ[J].JMolCellCardiol, 2014,7(72):85-94.

[12] Garg P K, McClelland R L, Jenny N S, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and their relation to premature atherosclerosis in β-thalassemia children[J].Hematology, 2015,20(4):228-38.

[13] Yang S, Li R, Tang L, et al. TLR4-mediated anti-atherosclerosis mechanisms of angiotensin-converting enzyme inhibitor-fosinopril[J].CellImmunol, 2013,285(2):38-41.

[14] Zhang Y, Yang X, Bian F, et al. TNF-α promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells: crosstalk between NF-κB and PPAR-γ[J].JMolCellCardiol, 2014,7(72):85-94.