田 煒，粟正英，藍(lán) 富，李釗全，何盈萱，侯華新

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

骨肉瘤是骨惡性腫瘤中最多見的一種，其生長(zhǎng)迅速、惡性程度高，目前仍是兒童和青少年惡性腫瘤死亡率很高的疾病。臨床上對(duì)于骨肉瘤的治療主要采取手術(shù)、放療并輔以化療的治療方案，能夠使部分患者病情得到有效控制，但仍有大部分患者因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而難以救治[1]。由于骨組織密度大、硬度高、滲透性差、生理生化過程復(fù)雜等原因，順鉑、阿霉素、環(huán)磷酰胺等傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物很難到達(dá)患病部位[2-3]。因此，迫切需要研發(fā)療效確切的新型抗腫瘤藥物。大黃酸是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效成分之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化和協(xié)同抗腫瘤等生物活性，且具有較強(qiáng)的趨骨性[4-5]。但其水溶性差、抗腫瘤作用弱等原因制約了其進(jìn)一步應(yīng)用。

本文以大黃酸為先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)修飾在1,8位進(jìn)行雙乙?；鰪?qiáng)化合物的水溶性，并在3位通過直鏈烷烴為橋鏈引入鹵素-Br以增強(qiáng)化合物的抗腫瘤活性。同時(shí)，以骨肉瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討合成產(chǎn)物對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的作用機(jī)制，為設(shè)計(jì)和開發(fā)新型蒽醌類抗骨肉瘤藥物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞為人骨肉瘤細(xì)胞株，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2試劑 大黃酸購(gòu)自南京郎澤生物醫(yī)藥，純度>98%；甲醇(色譜純，上海阿拉丁)；噻唑藍(lán)(MTT，北京Solarbio公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco公司)；胰酶(美國(guó)Amersco公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；周期檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；其余試劑均為市售分析純。

1.1.3儀器 X-5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京和眾視野科技公司)；SPECTRUM 100傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司)；Bruker-500核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，德國(guó)Bruker公司)；TU-1901紫外光譜儀(北京普析通用儀器公司)；LC-15C島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

2 方法

2.1合成方法目標(biāo)化合物的合成路線見Fig 1。

2.1.11,8-二乙酰大黃酸的合成(A) 室溫下將100 mg大黃酸溶于20 mL醋酐，0℃條件下緩慢滴加0.3 mL H2SO4，升溫至30℃攪拌反應(yīng)4～5 h。將反應(yīng)液倒入4℃的純水中，攪拌析出固體，抽濾，濾餅用純水洗滌3次，無水乙醇重結(jié)晶，真空干燥得淡黃色針狀晶體，110 mg，產(chǎn)率85%，mp: 245.8～247.3 ℃(文獻(xiàn)值[6]：247～248℃)。

Fig 1 Synthesis of target compoundReagents and conditions: i) (AcO)2O, H2SO4, 0～30℃, 4～5 h; ii) DMF, 1,2-dibromoethane, K2CO3, 60℃, 2 h.

2.1.21,8-二乙?；簏S酸-(2-溴)-乙酯的合成(B) 化合物A 100 mg溶于10 mL無水DMF中，加入200 mg無水碳酸鉀，0.5 mL 1,2-二溴乙烷，60℃條件下攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)(石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1)至原料點(diǎn)消失，約2 h，停止反應(yīng)。過濾除去碳酸鉀，反應(yīng)液倒入50 mL二氯甲烷中，有機(jī)相用純水(3×30 mL)洗滌，分液漏斗分液，無水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑得粗品。經(jīng)硅膠柱層析(100～200目)，石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1洗脫，二氯甲烷+石油醚重結(jié)晶得大黃酸衍生物B。

2.2高效液相色譜法測(cè)定化合物的純度樣品的配制：精密稱取1.0 mg大黃酸和1.0 mg大黃酸衍生物B，用四氫呋喃溶解，定容至10 mL，過0.45 μm的濾膜，備用。

色譜條件：Sino Chrom ODS-BP 5μm色譜柱；柱長(zhǎng)：150 mm；管徑：4.6 mm；流動(dòng)相 ∶甲醇-0.1%磷酸水(85 ∶15)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，進(jìn)樣體積：10 μL。

樣品測(cè)定：用流動(dòng)相平衡色譜柱后，首先進(jìn)樣10 μL的純四氫呋喃溶劑，在上述色譜條件下測(cè)定溶劑峰；然后分別進(jìn)樣大黃酸、大黃酸衍生物B、大黃酸和大黃酸衍生物B的混合物各10 μL，在上述相同色譜條件下測(cè)定。數(shù)據(jù)分析均在島津LC-15 Solution系統(tǒng)中運(yùn)行，扣除溶劑峰，再利用歸一化法計(jì)算化合物純度。

2.3化合物脂水分配系數(shù)LogP值計(jì)算本文采用Chemoffice2010(USA)軟件中的Cambridge Soft Corporation模塊，計(jì)算先導(dǎo)化合物大黃酸和合成產(chǎn)物大黃酸衍生物B的LogP值。

2.4MTT法測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞貼壁24 h后，小心棄去原培養(yǎng)基，分別加入100 μL濃度為0、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol·L-1的大黃酸和大黃酸衍生物B溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，置37℃、5% CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心棄去上清，每孔加入100 μL DMSO溶解，低速震蕩10 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=[1-(加藥組OD值/空白組OD值)]×100%。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁24 h后，小心棄去上清，分別加入0、40、80 μmol·L-1的大黃酸和大黃酸衍生物B溶液，每個(gè)濃度平行設(shè)置3孔。置37℃、5% CO2孵育箱中孵育48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞并用PBS漂洗2～3次，將細(xì)胞重懸于100 μL的Binding buffuer中，分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.6流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁24 h后，小心棄去上清，分別加入0、40 μmol·L-1的大黃酸和大黃酸衍生物B溶液，置37℃、5% CO2孵育箱中孵育48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞并用PBS漂洗2～3次。70%乙醇-20℃固定過夜，加入10 μL RNaseA、10 μL碘化丙啶(PI)，室溫下下避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的分布。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

3 結(jié)果

3.11,8-二乙?；簏S酸-(2-溴)-乙酯的結(jié)構(gòu)鑒定淺綠色針狀晶體，85 mg，產(chǎn)率66%，純度>98%(HPLC)，mp：(191.8～192.3)℃。UV-vis (DMSO) λmax: 260, 341 nm；IR (KBr, cm-1)：3096.91, 3034.64, 2977.46, 2948.39, 1779.50, 1765.63, 1717.90, 1675.80, 1667.71, 1593.88, 1448.31, 1420.53, 1366.55, 1333.60, 1275.54, 1255.51, 1238.62, 1216.26, 1189.84, 1098.12, 1024.28, 924.95, 898.18, 885.12, 800.14, 750.21, 702.51, 567.10, 504.32, 426.97.1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.84 (d,J=1.2 Hz, 1H), 8.25 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.05 (d,J=1.2 Hz, 1H), 7.80 (t,J=7.9 Hz, 1H), 7.44 (d,J=7.9 Hz, 1H), 4.70 (t,J=6.1 Hz, 2H), 3.67 (t,J=6.1 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.45 (s, 3H).13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ(ppm): 181.09, 180.35, 169.29, 169.16, 163.47, 150.31, 150.18, 130.80, 130.55, 128.56, 126.44, 125.68, 125.60, 65.15, 28.12, 21.06, 21.01.

3.2化合物的純度測(cè)定甲醇和(0.1%磷酸)水的比例為85:15的時(shí)候原料大黃酸與雜質(zhì)的峰、大黃酸與目標(biāo)化合物的峰都能依次分開，且出峰時(shí)間合適，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)n>5 000，峰型對(duì)稱，測(cè)得大黃酸和大黃酸衍生物B的純度均高于98%。

3.3化合物的LogP值計(jì)算LogP為化合物在非水相中的平衡濃度與其在水相中的中性形式平衡濃度的比值的對(duì)數(shù)，LogP值越小，表示化合物的水溶性越強(qiáng)。大黃酸的LogP理論計(jì)算值為3.53，大黃酸衍生物B的LogP理論計(jì)算值為3.12，計(jì)算結(jié)果表明大黃酸衍生物B的水溶性優(yōu)于大黃酸。

3.4化合物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與空白對(duì)照組相比，在低濃度<8 μmol·L-1時(shí)，大黃酸對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞幾乎沒有抑制作用；大黃酸衍生物B有一定的抑制作用，抑制率在7.36%～14.14%。隨著大黃酸和大黃酸衍生物B濃度的增加，骨肉瘤MG-63細(xì)胞的抑制率相應(yīng)增大，且呈濃度依賴性；作用48 h的IC50分別為110.60、25.78 μmol·L-1，且相同濃度下的大黃酸衍生物B對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于大黃酸(Tab 1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇大于大黃酸衍生物B的IC50濃度進(jìn)行。

Tab 1 The inhibitory effect of rhein and rhein derivatives B on MG-63 cells (±s, n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsrhein

3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡由Fig 2結(jié)果可知，大黃酸和大黃酸衍生物B均能誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。大黃酸和大黃酸衍生物B在40 μmol·L-1濃度時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率分別是(5.00±1.06)%、(17.16±0.87)%；80 μmol·L-1濃度時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率分別是(6.87±0.53)%、(48.84±2.20)%，說明大黃酸和大黃酸衍生物B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有一定的濃度依賴性，并且相同濃度下的大黃酸衍生物B誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的凋亡率明顯高于大黃酸(P<0.01)。

Fig 2 Effect of rhein and rhein derivatives B on apoptosis of MG-63 cells (±s, n=3)

FACS analysis showed annexin V-PE versus 7-AAD staining. The apoptotic rates of MG-63 cells treated with rhein and rhein derivatives B 48 h were detected.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsrhein.

3.6流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期如Fig 3所示，空白MG-63細(xì)胞的G1、G2和S期細(xì)胞數(shù)分別為(75.25±0.39)%、(11.96±0.29)%、(12.80±0.10)%；經(jīng)40 μmol·L-1大黃酸在和大黃酸衍生物B處理后，G1、G2和S期細(xì)胞數(shù)分別為(70.38±0.57)%、(11.31±0.22)%、(18.32±0.40)%和(31.92±1.05)%、(8.40±0.79)%、(59.68±1.17)%。細(xì)胞周期結(jié)果表明，大黃酸和大黃酸衍生物B可使MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在S期，且相同濃度下大黃酸衍生物B對(duì)細(xì)胞S期的阻滯作用明顯強(qiáng)于大黃酸(P<0.01)。

4 討論

大黃酸是中藥大黃的有效成分之一，具有協(xié)同抗腫瘤活性和良好的人體耐受力。其結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類似，具有較強(qiáng)的骨靶向性，能將藥物相對(duì)特異地轉(zhuǎn)運(yùn)至骨組織[7]，但其在抗腫瘤方面的應(yīng)用受到水溶性差和生物活性低的制約。因此，針對(duì)其水溶性差，研究者們目前主要集中在大黃酸的1,8位同時(shí)進(jìn)行酯化，以改善化合物的水溶性[8]；其前體藥物1,8-二乙?；簏S酸(雙醋瑞因，diacerein)作為治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，已經(jīng)在意大利上市。研究發(fā)現(xiàn)，雙醋瑞因可抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的增殖，而無誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[9]。此外，大黃酸的蒽醌三環(huán)共平面結(jié)構(gòu)可以嵌入到DNA的堿基對(duì)中，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)可逆性的結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA裂解和影響DNA的轉(zhuǎn)錄、合成，達(dá)到抗腫瘤的作用[10]。Yao 等[11]發(fā)現(xiàn)，通過側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的修飾可以提高蒽醌類化合物對(duì)DNA的嵌入作用，在大黃酸的3位側(cè)鏈上通過酰胺鍵引入芳環(huán)類α-氨基磷酸酯結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)大黃酸的抗腫瘤活性，當(dāng)在芳環(huán)的鄰位引入甲氧基時(shí)，得到1個(gè)體外抗腫瘤活性略優(yōu)于5-氟尿嘧啶的化合物。Liang等[12]在大黃酸的3,4位引入噻唑類衍生物以提高大黃酸抗腫瘤活性，合成的系列大黃酸衍生物的體外抗腫瘤活性雖然有所提高，但化合物的水溶性明顯降低，其所有衍生物的LogP理論計(jì)算值均高于大黃酸。

Fig 3 Distribution of cell cycle of each group (±s, n=3)

MG-63 cells treated with rhein and rhein derivatives B for 48 h were harvested for analysis of cell cycle distribution by flow cytometry.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsrhein.

本文設(shè)計(jì)合成的1,8-二乙?；簏S酸-(2-溴)-乙酯(大黃酸衍生物B)，在保留具有一定骨靶向性的大黃酸母核結(jié)構(gòu)的同時(shí)，在1,8位通過乙?；纳屏嘶衔锏乃苄裕⒃诖簏S酸的3位進(jìn)行側(cè)鏈修飾，增強(qiáng)了抗腫瘤活性。大黃酸衍生物B的LogP理論計(jì)算值低于大黃酸，說明大黃酸衍生物B的水溶性強(qiáng)于大黃酸；其次，由MTT結(jié)果可知，大黃酸衍生物B的體外抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于大黃酸。推測(cè)其作用機(jī)制可能是因?yàn)樵诖簏S酸的3位側(cè)鏈修飾，引入的鹵素-Br增強(qiáng)了化合物與DNA的相互作用，從而提高化合物的抗腫瘤活性。

調(diào)控細(xì)胞周期和(或)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為目前治療惡性腫瘤的一個(gè)重要策略。有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)大黃酸處理肝癌HepG2、BEL-7402細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人舌鱗癌SCC-4細(xì)胞后，可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷、線粒體跨膜電位的喪失、ATP產(chǎn)生減少，F(xiàn)OXO3a介導(dǎo)的Bim蛋白上調(diào)，抑制DNA修復(fù)相關(guān)基因O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)和周期素A、E的表達(dá)[13-15]，將細(xì)胞阻滯在S期，最終誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃酸衍生物B可改變 MG-63細(xì)胞周期的分布，與對(duì)照組相比，G2/M期細(xì)胞的比例減少，S期細(xì)胞所占比例明顯增高，細(xì)胞凋亡率明顯提高。提示大黃酸衍生物B可使細(xì)胞周期阻滯于S期，阻斷癌細(xì)胞由S期向G2/M期的進(jìn)程，阻滯細(xì)胞的有絲分裂，通過抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的效果。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室和生命科學(xué)研究院完成，特此致謝。)

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