王景尚，孫明月，殷惠軍，黃 燁

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100026；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院臨床藥理中心，北京 100091；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；4.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院急診科，北京 100091)

糖尿病血管并發(fā)癥是引起患者高致殘率和高致死率的主要原因[1]。慢性穩(wěn)定性高血糖和波動性高血糖是糖尿病患者高血糖的兩種主要表現(xiàn)形式。研究表明，高血糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，且以波動高糖損傷為重，同時高血糖通過多種機(jī)制導(dǎo)致血小板黏附、聚集和釋放功能失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)過度活化狀態(tài)[2-3]?；谘“寤罨趧用}血栓形成的重要作用，阿司匹林已成為糖尿病患者預(yù)防心血管病變的推薦藥物[4]。然而，目前尚缺乏關(guān)于波動性高血糖對內(nèi)皮損傷過程中血小板活化程度影響的相關(guān)研究，同時，阿司匹林對此過程具有怎樣的影響亦未可知?；诖?，本研究通過體外構(gòu)建人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)血糖波動模型以及波動高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷培養(yǎng)液和健康人血小板共孵育體系，體內(nèi)構(gòu)建2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠血糖波動模型，觀察阿司匹林對波動高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷過程中血小板活化的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與藥物清潔級♂ SD大鼠，體質(zhì)量170 g～190 g，購自中國食品藥品檢定研究院，許可證編號：SCXK(京)2009-0017。動物飼料購自北京華富康飼料公司，高糖高脂飼料：豬油20%(W/W)、蔗糖10%(W/W)、膽固醇1.25%(W/W)、膽酸鹽0.25%(W/W)、普通飼料68.5%。高升糖指數(shù)(glucose index，GI)飼料：每公斤飼料含糯玉米淀粉(蠟質(zhì)玉米淀粉)542 g、凝膠20 g、酪蛋白200 g、蔗糖85 g、豆油56 g、麥麩50 g、DL-蛋氨酸2 g、維生素混合物10 g、礦物質(zhì)混合物35 g。低升糖指數(shù)(GI)飼料配方：每公斤飼料含高直鏈玉米淀粉542 g、凝膠20 g、酪蛋白200 g、蔗糖85 g、豆油56 g、麥麩50 g、DL-蛋氨酸2 g、維生素混合物10 g、礦物質(zhì)混合物35 g。阿司匹林(acetylsalicylic acid，ASA，批號：BJ10194)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

1.2HUVECs的培養(yǎng)與分組無菌條件下取健康產(chǎn)婦正常分娩的新生兒臍帶，HUVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定參照J(rèn)affe等[5]的方法。所用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均為第3-5代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常低糖(N)組：持續(xù)低糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；穩(wěn)定性高糖(W)組：持續(xù)高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；波動性高糖(B)組：高糖型DMEM全培養(yǎng)基/低糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24 h更換1次；波動性高糖組+阿司匹林(ASA)組：波動性高糖組進(jìn)行阿司匹林(1 mmol·L-1)干預(yù)，阿司匹林劑量是應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)試劑盒測得的半數(shù)致死量。培養(yǎng)8 d，收集各組培養(yǎng)上清液，置于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3健康人血小板采集健康志愿者15例，年齡20～45歲，近2周未發(fā)生炎癥性疾病，未服用任何藥物。于清晨進(jìn)食前，將收集所得的健康人枸櫞酸鈉抗凝(1 ∶9)血提取富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)、貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，用PPP調(diào)整PRP至2.0×1011～3.0×1011·L-1備用。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)人血小板聚集實(shí)驗(yàn)將N組、W組和B組培養(yǎng)8 d收集到的細(xì)胞上清液，進(jìn)行編號分別為①、②、③。將收集到的健康人PRP加入刺激劑(正常低糖組、穩(wěn)定性高糖組和波動性高糖組分別加①、②、③號上清液、阿司匹林干預(yù)組加③號上清液)10 μL進(jìn)行溫育處理。應(yīng)用血小板聚集儀進(jìn)入測試狀態(tài)，在窗口讀取血小板最大聚集率。

1.5動物模型制備與分組60只SD大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，隨機(jī)抽取10只作為正常對照組(N組)。對余下50只進(jìn)行定時高糖高脂飼料喂食4 周，給予1次性經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1)，3 d后測定模型大鼠空腹和餐后2 h血糖，以空腹血糖大于11.1 mmol·L-1且餐后血糖不大于33.3 mmol·L-1做為入組標(biāo)準(zhǔn)，成功納入2型糖尿病大鼠32只分為：穩(wěn)定高糖組(W組，11只)：每日定時喂食低GI飼料；波動高糖組(B組，11只)：每日定時喂食高GI飼料；波動高糖+阿司匹林組(ASA組，10只)：根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》實(shí)驗(yàn)動物與人按體表面積比等效劑量換算表，換算阿司匹林用藥劑量[6]。即每日定時喂食高GI飼料，并按60 mg·kg-1·d-1灌服阿司匹林混懸液。正常組(N組，10只)：每日定時喂食基礎(chǔ)飼料，并灌服等體積蒸餾水。各組干預(yù)6 周后，大鼠腹主動脈采血，5 mL促凝血分離血清，用于生化指標(biāo)、內(nèi)皮損傷指標(biāo)檢測；采集1 mL 3.8%枸櫞酸鈉(pH 7.4)1 ∶9抗凝血取材，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.6檢測指標(biāo)

1.6.1大鼠體重和血清生化指標(biāo)的測定 采用己糖激酶法測定大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，采用酶法測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglycerides，TG)，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平。

1.6.2內(nèi)皮損傷指標(biāo)檢測 大鼠腹主動脈采血，5 mL促凝血分離血清，采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液和大鼠血清可溶性E-選擇素(sE-selectin)和血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)水平。

1.6.3大鼠血小板膜蛋白CD62p水平測定 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜蛋白CD62p表達(dá)，于采血2 h內(nèi)完成檢測。

1.6.4血小板聚集率測定 應(yīng)用血小板聚集儀進(jìn)行測定，讀取血小板最大聚集率。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血脂水平如Tab 1所示，與N組相比，W組和B組糖尿病大鼠血清FPG、TC、TG均明顯升高(P<0.01)，大鼠體質(zhì)量和FINS明顯降低(P<0.01)，但W組和B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與B組相比，阿司匹林對大鼠體質(zhì)量、血糖、血脂水平無明顯作用。

2.2阿司匹林對波動高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷的影響如Fig 1所示，與N組相比，W組和B組細(xì)胞上清vWF和sE-selectin含量明顯增多(P<0.01)，且B組與W組之間差異具有顯著性(P<0.05)；ASA干預(yù)后，細(xì)胞上清vWF和sE-selectin含量均明顯下降(P<0.01)。

2.3阿司匹林對T2DM血糖波動大鼠模型內(nèi)皮功能損傷的影響與N組相比，W組和B組T2DM大鼠血清vWF、sE-selectin水平均明顯升高(P<0.01)，且B組更加明顯(P<0.05，P<0.01)；與B組相比，ASA組大鼠血清vWF、sE-selectin水平明顯降低(P<0.01)。見Fig 2。

Tab 1 Effects of aspirin on weight, blood glucose and serum lipid of T2DM rats with high glucose fluctuation

N:normal glucose; W: steady high glucose; B: fluctuant high glucose; ASA: aspirin group.**P<0.01vsN group

Fig 1 Effects of aspirin on levels of vWF, sE-selectin in HUVECs with high glucose fluctuation

N:normal glucose; W: steady high glucose; B: fluctuant high glucose; ASA: aspirin group.**P<0.01vsN group;#P<0.05vsW group;△△P<0.01vsB group

Fig 2 Effects of aspirin on serum vWF, sE-selectin of T2DM rats with high glucose fluctuation

N:normal glucose; W: steady high glucose; B: fluctuant high glucose; ASA: aspirin group.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsW group;△△P<0.01vsB group

2.4阿司匹林對不同葡萄糖培養(yǎng)條件下血小板最大聚集率的影響如Fig 3所示，與N組相比，W組和B組健康人外周血血小板最大聚集率均明顯增高(P<0.01)，且B組與W組之間差異有顯著性(P<0.01)；運(yùn)用ASA藥物預(yù)處理15 min后，波動性高糖誘導(dǎo)的血小板最大聚集率明顯降低(P<0.01)。

Fig 3 Effects of aspirin on platelet maximum aggregation rate in HUVECs with high glucose fluctuation

N:normal glucose; W: steady high glucose; B: fluctuant high glucose; ASA: aspirin group.**P<0.01vsN group;##P<0.01vsW group;△△P<0.01vsB group

2.5阿司匹林對T2DM血糖波動模型大鼠血小板膜蛋白CD62p水平的影響與N組相比，W組和B組大鼠血小板膜蛋白CD62p表達(dá)均明顯增多(P<0.01)，且B組與W組之間差異有顯著性(P<0.05)；應(yīng)用ASA干預(yù)后，大鼠血小板膜蛋白CD62p表達(dá)明顯下降(P<0.01)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of aspirin on platelet membrane protein level of CD62p in T2DM rats with high glucose fluctuation

N:normal glucose; W: steady high glucose; B: fluctuant high glucose; ASA: aspirin group.**P<0.01vsN group;#P<0.05vsW group;△△P<0.01vsB group

3 討論

血小板的高活性狀態(tài)是糖尿病血管病變的一個重要因素[7]。血小板活化、黏附、聚集于血管內(nèi)皮損傷部位，釋放生長因子，促進(jìn)平滑肌增殖，導(dǎo)致動脈粥樣硬化，引起糖尿病大血管病變；血小板的高黏附、高聚集狀態(tài)造成微循環(huán)淤滯，導(dǎo)致組織缺氧，又可引起糖尿病的微血管病變[8]。因此，在T2DM早期有效抗血小板活化治療對于預(yù)防糖尿病血管病變的發(fā)生、發(fā)展具有積極的臨床意義。血糖波動性在糖尿病血管損傷中的作用已經(jīng)為大家所公認(rèn)，然而其在促進(jìn)血小板活化中所發(fā)揮的作用尚不明確。

vWF是血管內(nèi)皮功能異常的特異性表達(dá)分子。同時，vWF還具有明顯誘導(dǎo)血小板聚集的功能[9]。E-selectin是唯一僅限于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子，是內(nèi)皮細(xì)胞活化的一個重要標(biāo)志[10]。CD62p是血小板活化的特異標(biāo)志物[11]，當(dāng)血小板受到各種刺激時，才會大量表達(dá)于血小板膜表面，進(jìn)而介導(dǎo)黏附反應(yīng)，參與血栓形成過程和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，穩(wěn)定高糖和波動高糖均可誘導(dǎo)HUVECs中vWF和sE-selectin水平升高，且以波動組更為明顯。進(jìn)一步我們應(yīng)用波動高糖和穩(wěn)定高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷上清液溫浴健康人血小板，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者均能明顯誘導(dǎo)血小板聚集，且以波動組誘導(dǎo)的血小板聚集率升高明顯。同時，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建的T2DM血糖波動大鼠中出現(xiàn)了明顯的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時大鼠血小板膜蛋白CD62p表達(dá)明顯升高，表明其存在更為明顯的血小板活化狀態(tài)。

阿司匹林是臨床常用藥物，其治療作用隨劑量而有差異，具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎以及抑制血小板聚集等作用[12]。隨著對該藥研究的深入，近年來又發(fā)現(xiàn)了阿司匹林的一些新應(yīng)用，包括心腦血管病、腫瘤、阿爾茨海默病、預(yù)防流產(chǎn)等。阿司匹林可通過抑制血小板活化聚集、抗炎、抗氧化等機(jī)制，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程，因而也成為糖尿病患者心腦血管事件一、二級預(yù)防的基石[13]。本研究對其在血糖波動狀態(tài)下的血管內(nèi)皮功能及血小板活化狀態(tài)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，阿司匹林不僅能夠有效保護(hù)波動高糖所誘導(dǎo)的HUVECs和T2DM大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而且能有效抑制波動高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷過程中所出現(xiàn)的血小板聚集和活化，提示阿司匹林在糖尿病預(yù)防中具有保護(hù)內(nèi)皮和抗血小板活化的雙重效應(yīng)，但其確切的作用機(jī)制仍有待我們進(jìn)行深入研究。

(致謝：本研究在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝實(shí)驗(yàn)中心楊琳和繆宇老師給予的支持，感謝血液科實(shí)驗(yàn)室許勇鋼老師在血小板膜蛋白CD62p檢測中給予的幫助。)

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