馬 瀅，方 萌，伍 超，徐媛媛， 陶相明， 汪亭君，羅 鎮(zhèn)，杜保根，楊 雁

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室和天然藥物研究所，安徽 合肥 230032)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，一般由慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化-HCC的順序逐漸演變而來(lái)。由于HCC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前仍缺少有效的防治措施。HCC的中藥治療是其防治的重要研究方向。丹參是治療肝纖維化最常用的中藥之一，丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是其水溶性提取物之一。通過(guò)雙盲雙模擬臨床觀察與治療前后肝組織病理活檢，證實(shí)Sal B能有效逆轉(zhuǎn)慢性乙型肝炎-肝纖維化[1]。Sal B通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，減少膠原纖維的沉積而發(fā)揮抗肝纖維化作用。有研究報(bào)道，Sal B高濃度可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[2]，促進(jìn)其凋亡[3]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming grow factor beta 1，TGF-β1)是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)因子，其介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化-HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究表明，Smad3不同位點(diǎn)磷酸化在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的效應(yīng)，其C-末端活化形式pSmad3C，靶向下游基因p21，介導(dǎo)腫瘤抑制信號(hào)，而其連接區(qū)活化形式pSmad3L，靶向下游基因纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI- 1)及c-Myc，介導(dǎo)促纖維化-癌變信號(hào)[6]。我們推測(cè)，Sal B可能通過(guò)干預(yù)pSmad3C/pSmad3L而發(fā)揮抗肝纖維化-HCC作用。因此，本研究建立二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化-HCC模型，觀察Sal B對(duì)小鼠肝纖維化-HCC進(jìn)程的影響，并探討Sal B經(jīng)由pSmad3C/p21、pSmad3L/PAI-1/c-Myc信號(hào)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑DEN(0.95 kg·L-1)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Sal B(純度≥95%,批號(hào)：PS12091001)、秋水仙堿(colchicine，Col)(純度≥98%，批號(hào)：PS08092201)，購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。Western blot及IP細(xì)胞裂解液、PMSF購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗pSmad3L(linker-phosphorylated Smad3)多克隆抗體由日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)松崎教授惠贈(zèng)；兔抗pSmad3C(C-terminally phosphorylated Smad3)單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；兔抗PAI-1(PA5-27216)多克隆抗體購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗c-Myc(ab32072)單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；小鼠抗p21單克隆抗體(556430)購(gòu)自BD Biosciences公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG，均購(gòu)自北京中杉金橋；苦味酸、品紅，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.2DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化-HCC模型建立及SalB干預(yù)♂昆明系小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk(皖)2011-002。100只♂小鼠，隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型組、Sal B低劑量(15 mg·kg-1)組、Sal B高劑量 (30 mg·kg-1)組、陽(yáng)性藥物Col(0.2 mg·kg-1)組，每組20只。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射無(wú)菌生理鹽水，其余組小鼠給予1.0% DEN溶液(無(wú)菌生理鹽水配置)誘導(dǎo)肝纖維化-HCC模型，按體質(zhì)量10 mL·kg-1給藥，每周1次，連續(xù)16周。于造模當(dāng)天開(kāi)始，Sal B組小鼠分別給予15、30 mg·kg-1·d-1Sal B灌胃，陽(yáng)性藥物組小鼠給予0.2 mg·kg-1·d-1Col灌胃，正常對(duì)照組小鼠給予相應(yīng)溶媒灌胃，持續(xù)給藥至16周末。于第12周末處死小鼠5只，16周末處死小鼠8只，取材，進(jìn)行組織固定、病理檢測(cè)或蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期觀察記錄小鼠進(jìn)食狀況、體重變化、活動(dòng)情況及外表征象。

1.3.2肝臟指數(shù) 小鼠處死后，切取全部肝臟，生理鹽水清洗血跡，濾紙吸干，稱取肝臟重量(Wl)、體質(zhì)量(Wb)，計(jì)算肝臟指數(shù)(Wl/Wb)×100%。

1.3.3病理觀察 切取肝臟左葉，4%多聚甲醛溶液固定48 h，脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，烤片；梯度酒精脫蠟，水化，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹(shù)膠封片。按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，使用數(shù)字掃描儀顯微鏡隨機(jī)拍攝肝細(xì)胞團(tuán)顯微照片5張，由病理醫(yī)師閱片、診斷和評(píng)價(jià)，確定肝臟病變程度。

1.3.4Van Gieson(VG)染色 配制VG染液：A液，1%酸性品紅水溶液；B液，苦味酸飽和水溶液，臨用前按 A ∶B=1 ∶9的比例混合。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗，用濾紙吸干水分，VG染液染色5 min左右，95%酒精分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察膠原纖維分布情況。

1.4Westernblot法檢測(cè)pSmad3C、pSmad3L、p21、PAI-1、c-Myc蛋白表達(dá)常規(guī)方法提取小鼠肝組織中細(xì)胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別以小鼠抗GAPDH、兔抗pSmad3C、兔抗pSmad3L、小鼠抗p21、兔抗PAI-1、兔抗c-Myc抗體4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，繼而以相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記lgG常溫孵育90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法曝光顯影。采用Image J軟件對(duì)Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，分析結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的比值表示。

2 結(jié)果

2.1SalB可改善DEN誘導(dǎo)的肝纖維化-HCC小鼠的一般狀況正常組小鼠飲食好，活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈活，背毛柔順有光澤，體重明顯增加；模型組小鼠在誘癌初期，食欲良好，體重未減輕，12周后，模型組小鼠出現(xiàn)皮毛枯槁無(wú)光澤、食欲不振、活動(dòng)減少等表現(xiàn)，體重逐漸減輕；和模型組比較，Sal B組癥狀改善，食欲增加，精神狀況較好。DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化-HCC過(guò)程中，部分小鼠因耐受能力較差，出現(xiàn)灌藥后死亡等，至DEN誘癌第16周取材時(shí)統(tǒng)計(jì)，各組小鼠死亡率分別為正常對(duì)照組(0/20，0.0%)、模型組(7/20，35.0%)、Sal B低劑量組(5/20，25.0%)、Sal B高劑量組(3/20，15.0%)、Col組(6/20，30.0%)。

2.2SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝纖維化期小鼠體質(zhì)量與肝臟系數(shù)的影響與正常組相比，12周末時(shí)，模型組小鼠體質(zhì)量、肝重與肝臟系數(shù)明顯降低；與模型組比較，Sal B組小鼠體質(zhì)量與肝重有增加的趨勢(shì)，肝臟系數(shù)無(wú)明顯變化(Tab 1)。

Tab 1 Comparison of liver weight and liver index of five groups at 12th week(±s, n=5)

##P<0.01vscontrol

2.3SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝纖維化期小鼠肝臟大體形態(tài)的影響Fig 1A小鼠肝臟大體可見(jiàn)，正常組小鼠肝臟表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟；12周末模型組小鼠肝臟表面粗糙，邊緣變鈍；與模型組比較，Sal B組小鼠肝臟表面較光滑，質(zhì)地較柔軟，癥狀改善。

2.4SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝纖維化期小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響如Fig 1B、1C所示，第12周時(shí)，光鏡所見(jiàn)，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，有肝小葉和匯管區(qū)，VG陽(yáng)性膠原纖維僅局限于門管區(qū)和小葉間靜脈周圍；模型組肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維增生，大量膠原纖維分隔肝小葉結(jié)構(gòu)形成假小葉結(jié)構(gòu)；Sal B組炎細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維增生均輕于模型組，未形成假小葉結(jié)構(gòu)。Sal B組小鼠肝組織病變程度減輕。提示第12周為纖維化病變期，Sal B具有抗肝纖維化的作用。

2.5SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝纖維化期小鼠肝組織中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1、p21蛋白表達(dá)的影響Fig 1D Western blot結(jié)果顯示，12周時(shí)，正常肝組織中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1蛋白表達(dá)均較少，p21蛋白幾乎不表達(dá)；與正常組相比，模型組肝組織中pSmad3C蛋白無(wú)明顯變化，p21蛋白表達(dá)增多，pSmad3L和PAI-1蛋白表達(dá)明顯增多；與模型組比較，Sal B組肝組織中pSmad3C、p21蛋白水平明顯升高，pSmad3L、PAI-1蛋白水平明顯降低。提示Sal B抗小鼠肝纖維化時(shí)，升高pSmad3C、p21蛋白，降低pSmad3L和PAI-1蛋白的表達(dá)。

2.6SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC癌前階段體質(zhì)量與肝臟系數(shù)的影響16周末時(shí)，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量、肝重與肝臟系數(shù)明顯減少；與模型組比較， Sal B組小鼠體質(zhì)量、肝重與肝臟系數(shù)明顯增加, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。

Fig 1 Effects of Sal B on hepatic fibrosis induced by DEN in mice (HE, × 100; VG, × 100)

A: General appearance of liver; B: HE staining of liver tissue; C: VG staining of liver tissue; D: Protein expression detected by Western blot. 1: Control; 2: Model; 3: Sal B 15 mg·kg-1; 4: Sal B 30 mg·kg-1; 5: Col.##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

Tab 2 Comparison of liver weight and liver index of five groups at 16th week (±s, n=8)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsmodel

2.7SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC癌前病變期小鼠肝臟大體形態(tài)的影響由小鼠肝臟大體所見(jiàn)，正常組小鼠肝臟表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟；16周末，模型組肝臟表面粗糙，出現(xiàn)大量彌漫性結(jié)節(jié)，質(zhì)地堅(jiān)硬；與模型組比較，Sal B組小鼠肝臟結(jié)節(jié)少，質(zhì)地柔軟，癥狀改善(Fig 2A)。

2.8SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC癌前病變期小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響如Fig 2B所示，16周時(shí)光鏡下所見(jiàn)，正常組肝組織細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀有序排列，相鄰肝板吻合連接成網(wǎng)狀，肝細(xì)胞核圓，位于細(xì)胞中央，著色較淺，肝細(xì)胞無(wú)明顯變性與壞死；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞壞死發(fā)生在肝小葉內(nèi)、累及肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，壞死灶原有細(xì)胞消失，代以浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞。增生肝細(xì)胞具有癌細(xì)胞樣異型性，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大，且大小不一致，同時(shí)，肝細(xì)胞核體積變大，染色變深，分裂相增多；Sal B組肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、細(xì)胞核異型性均輕于模型組。提示16周為癌前病變期。12周、16周Sal B組小鼠肝組織病變程度均明顯減輕。Sal B延緩DEN誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化-HCC進(jìn)程。

2.9SalB對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC癌前病變期小鼠肝組織中pSmad3C、pSmad3L、c-Myc、PAI-1、p21蛋白表達(dá)的影響Fig 2C Western blot結(jié)果顯示，16周末，正常肝組織中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1表達(dá)均較少，c-Myc、p21蛋白幾乎不表達(dá)；與正常組相比，模型組肝組織中pSmad3C、P21蛋白表達(dá)增多，pSmad3L、c-Myc、PAI-1蛋白表達(dá)明顯增多；與模型組比較，Sal B組肝組織中pSmad3C蛋白水平明顯升高，p21蛋白水平幾乎無(wú)變化，pSmad3L、c-Myc、PAI-1蛋白水平明顯降低。提示Sal B延緩小鼠肝纖維化-HCC進(jìn)程時(shí)，升高pSmad3C蛋白水平，降低pSmad3L、PAI-1、c-Myc蛋白的表達(dá)。

Fig 2 Effects of Sal B on precancerous lesion of hepatocellular carcinoma induced by DEN in mice (HE, × 100)

A: General appearance of liver; B: HE staining of of liver tissue; C: Protein expression detected by Western blot . 1: Control; 2: Model; 3: Sal B 15 mg·kg-1; 4: Sal B 30 mg·kg-1; 5: Col.##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

3 討論

DEN作為N-亞硝基類物質(zhì)的一種，是遺傳毒性致癌物，其誘導(dǎo)HCC發(fā)生，一般經(jīng)過(guò)慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化-癌前病變-HCC等病變過(guò)程，與人類肝癌發(fā)病進(jìn)程相似[7]。小鼠具有可基因干預(yù)發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，DEN誘發(fā)小鼠肝臟癌前病變被用于預(yù)防肝癌藥物篩選的理想動(dòng)物模型[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用DEN腹腔注射給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEN能夠成功誘導(dǎo)小鼠肝纖維化、肝臟癌前病變模型。小鼠出現(xiàn)一般狀態(tài)不良、體質(zhì)量與肝臟重量降低、肝系數(shù)下降，炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞變性、膠原纖維增生，12周末出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu)，16周末增生肝細(xì)胞核異型性明顯，分別具備肝纖維化、HCC癌前病變的基本特征。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參的根，其味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛的功效。近年來(lái)，丹參、丹參復(fù)方制劑及丹參有效成分在慢性肝病治療，尤其是抗肝纖維化中得到廣泛應(yīng)用，其中丹參有效成分研究進(jìn)展迅速。Sal B是丹參中含量最高的活性成分[10]，也是水溶性成分中研究最多的成分之一。 Sal B可抑制和減輕四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)、二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)、TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。臨床試驗(yàn)也顯示，Sal B可明顯逆轉(zhuǎn)乙肝患者的肝纖維化。本次實(shí)驗(yàn)中，DEN誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化階段，與模型組比較，Sal B組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維增生明顯減輕。DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌癌前階段，Sal B組小鼠體質(zhì)量、肝重、肝臟系數(shù)明顯增加，肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞異型性均輕于模型組。表明Sal B具有抗DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化-HCC的作用，可以延緩小鼠肝纖維化-HCC疾病進(jìn)程，對(duì)小鼠肝纖維化和肝癌前病變具有防治作用。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，Sal B抗肝纖維化作用可能與TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。Sal B可抑制HSC中TGF-β1表達(dá)及其激酶的活性，抑制胞內(nèi)Smad2、Smad3的表達(dá)，Smad2的磷酸化及核轉(zhuǎn)位[11-12]。近年研究表明，TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有雙重作用。目前認(rèn)為，這種雙重作用與Smad3的C末端和L區(qū)磷酸化有關(guān)。在肝纖維化過(guò)程中，TGF-β1一方面通過(guò)TGF-β1/TβRI/pSmad3C/p21抑制肝纖維化的發(fā)生；另一方面，通過(guò)TGF-β1/MAPK/pSmad3L/PAI-1使得Smad3連接區(qū)磷酸化[13-14]，促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成，同時(shí)促進(jìn)下游靶基因PAI-1表達(dá)增強(qiáng)，抑制ECM降解，導(dǎo)致ECM過(guò)度堆積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠肝臟中pSmad3C/p21與pSmad3L、PAI-1蛋白表達(dá)均較少，DEN組中pSmad3C p21表達(dá)無(wú)明顯變化，pSmad3L和PAI-1表達(dá)明顯增多，Sal B組pSmad3C與p21表達(dá)明顯多于DEN組，pSmad3L和PAI-1表達(dá)明顯少于DEN組。因此，Sal B可能一方面通過(guò)TGF-β1/TβRI，促進(jìn)pSmad3C表達(dá)，進(jìn)而激活其下游p21蛋白表達(dá)，抑制肝纖維化。同時(shí)，通過(guò)TGF-β1/JNK通路下調(diào)pSmad3L及其下游靶基因PAI-1的表達(dá)，減少肝組織中ECM的合成，進(jìn)而延緩肝纖維化。

在HCC癌前階段，TGF-β1與Ⅰ型受體結(jié)合，促使Smad3C磷酸化，pSmad3C促使p21表達(dá)增多，傳遞腫瘤抑制信號(hào)。p21抑制受損DNA的復(fù)制和積累，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。炎癥因子激活JNK通路，促進(jìn)pSmad3L表達(dá)，進(jìn)而激活癌基因c-Myc表達(dá)，促使細(xì)胞增殖異常、細(xì)胞浸潤(rùn)而發(fā)生癌變，同時(shí)誘導(dǎo)PAI-1表達(dá)增多，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，活化間充質(zhì)細(xì)胞的ECM合成傳遞致瘤信號(hào)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠肝臟中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1、c-Myc蛋白表達(dá)均較少，DEN組pSmad3C表達(dá)無(wú)明顯變化，p21、pSmad3L、PAI-1、c-Myc表達(dá)明顯增多，Sal B組pSmad3L、PAI-1、c-Myc表達(dá)明顯少于DEN組，pSmad3C表達(dá)多于DEN組，p21表達(dá)無(wú)明顯變化。因此，Sal B的抗HCC作用可能主要通過(guò)抑制pSmad3L的表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游靶基因c-Myc和PAI-1表達(dá)，來(lái)阻礙HCC的發(fā)生發(fā)展。

綜上，DEN誘導(dǎo)肝纖維化-HCC進(jìn)程中，Sal B可能通過(guò)增強(qiáng)pSmad3C/p21介導(dǎo)的抑癌信號(hào)而減弱pSmad3L/PAI-1/c-Myc介導(dǎo)的促纖維化-癌變信號(hào)，阻礙肝纖維化-肝癌進(jìn)程。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)病理檢測(cè)部分得到安徽省立醫(yī)院病理科郭真理醫(yī)師指導(dǎo)分析，在此由衷地表示感謝。)

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