周林云，任文艷，廖云鵬，王 涵，朱茄慧，胡 瑩,李福書，周 婭，何百成

(重慶醫(yī)科大學 1. 藥理教研室； 2. 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

漢防己甲素(tetrandrine，Tet)是一種雙芐基異喹啉類生物堿，主要從多年生藤本防己科植物漢防己的塊根中提取。Tet作為一種鈣通道阻滯劑，具有多種藥理作用，已在臨床應用多年，主要用于治療矽肺、自身免疫性疾病、炎癥性肺部疾病、心血管疾病等。近年來研究表明，Tet對肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞具有增殖抑制和促進凋亡的作用[1-3]，并且對結(jié)腸癌還具有一定的預防作用[4]。除此之外，Tet對乳腺癌細胞也具有抑制增殖和促進凋亡的作用，機制可能與抑制PKC-α和逆轉(zhuǎn)耐藥等有關(guān)[5-6]，但具體分子機制仍不十分清楚。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGFs)是一類與胰島素具有高度同源序列的蛋白，IGFs與其受體結(jié)合后參與調(diào)節(jié)多種生理過程。 IGFs信號受到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGF binding proteins, IGFBPs)的調(diào)節(jié)。因此，當IGF信號異常時，可使細胞的多種生物學過程發(fā)生異常，最終導致腫瘤發(fā)生。其中，胰島素生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)表達異常與多種腫瘤有關(guān)。文獻報道，乳胰癌的發(fā)生也與IGF信號異常有關(guān)[7]。課題組前期研究表明，Tet通過促進IGFBP-5表達抑制結(jié)腸癌細胞增殖，但Tet對乳腺癌的作用是否與IGFBP-5有關(guān)，目前還不清楚。因此，本研究選用人乳腺癌MCF-7細胞，分析Tet對乳腺癌的增殖抑制作用，并探討IGFBP-5與Tet抑制乳腺癌細胞增殖作用的可能關(guān)系。

1 材料

1.1細胞株及細胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞購自ATCC(American Type Culture Collection)，用含10%胎牛血清，1%雙抗(100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基(高糖)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，待細胞生長至對數(shù)生長期時用0.25%胰酶消化傳代。

1.2試劑漢防己甲素購自Sigma-Aldrich公司；實驗所用IGFBP-5、p53等一抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司；CCK-8試劑盒購自上海七海復泰生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。

1.3儀器細胞培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標儀(基因公司)、倒置顯微鏡(Nikon 公司)、定量PCR儀(Bio-Rad)、流式細胞儀(BD公司)、電泳儀(北京六一)等。

2 方法

2.1重組腺病毒的構(gòu)建采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建IGFBP-5過表達和沉默IGFBP-5的siRNA片段重組腺病毒。過表達IGFBP-5(AdIGFBP-5)及沉默IGFBP-5(AdsiIGFBP-5)的重組腺病毒均由美國芝加哥大學何通川教授提供。僅表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重組腺病毒(AdGFP)用作載體對照。

2.2實驗設計及分組按實驗要求，將細胞分為對照組和實驗組。采用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解Tet，實驗組細胞采用不同濃度Tet或Tet合并相應重組腺病進行處理，對照組細胞則用相同體積的DMSO和(或)GFP重組腺病毒進行處理。

2.3CCK-8法檢測細胞增殖將生長良好的MCF-7細胞消化后，接種到96孔板中，每孔2 000個細胞。待細胞貼壁后，按實驗設計加入不同濃度的Tet(1、2、3、4、5 μmol·L-1)。分別于24、48、72 h后進行檢測，每孔加入10 μL CCK-8試劑，放入孵箱孵育2 h后，用酶標儀在450 nm處測定吸光值，并繪制增殖曲線。每組實驗重復3次。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡將生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞均勻種于6孔板，待細胞貼壁后，用不同濃度的Tet(1、2、4 μmol·L-1)或同體積DMSO進行處理。48 h后收集細胞，按試劑盒說明書進行操作，然后上機檢測進行周期分析。對細胞進行凋亡分析時，利用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，按試劑盒操作說明進行實驗，然后通過流式細胞儀檢測，進行凋亡分析。每組實驗重復3次。

2.5總RNA的提取與real-timePCR檢測將生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞消化后，接種到T25培養(yǎng)瓶，等細胞貼壁后加入不同濃度的Tet(1、2、4 μmol·L-1)或同體積DMSO進行處理。利用TRIzol法提取總RNA ，然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應制備cDNA。最后通過real-time PCR檢測目的基因mRNA表達水平變化情況。所用引物如下：GAPDH 上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′,下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；IGFBP-5上游引物5′-CGTTTCAGCCCTCATTTAATTC-3′，下游引物5′-CAG TTTTCCCAGAATGAGGAAG-3′。每組實驗重復3次。

2.6Westernblot實驗將生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞消化后均勻種于6孔板，用不同濃度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或同體積DMSO對細胞進行處理。按實驗設計，在相應時間點提取各組總蛋白，按常規(guī)方法進行Western blot實驗操作。最后，采用ECL試劑盒對目的條帶進行顯影并采集圖像。每組實驗重復3次。

3 結(jié)果

3.1Tet對MCF-7乳腺癌細胞生長的影響Fig 1A結(jié)果顯示，不同濃度的Tet(1、2、3、4、5 μmol·L-1)在體外對乳腺癌MCF-7細胞的增殖有明顯抑制作用，并呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。2 μmol·L-1Tet在48 h時，即可明顯誘導生長抑制。Fig 1B周期分析結(jié)果顯示，Tet明顯增加G1期細胞比例，降低S期細胞比例。Fig 1C的Western blot結(jié)果顯示，Tet呈濃度依賴性降低PCNA蛋白水平。以上結(jié)果提示， Tet對乳腺癌細胞MCF-7的增殖有明顯抑制作用。

Fig 1 Effects of Tet on proliferation of MCF-7 cells

A:CCK-8 assay results showed the anti-proliferation effect of Tet in MCF-7 cells (*P<0.05,**P<0.01vscontrol). B: Cell cycle analysis results showed the cell cycle arrest effect of Tet in MCF-7 cells. C: Western blot assay results showed the effect of Tet on the level of PCNA in MCF-7 cells

3.2Tet對MCF-7乳腺癌細胞凋亡的影響Fig 2A流式分析結(jié)果顯示， Tet呈濃度依賴性增加MCF-7細胞的凋亡比例。Fig 2B Western blot結(jié)果顯示，Tet升高Bad的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平。結(jié)果表明，Tet對乳腺癌MCF-7細胞的凋亡具有促進作用。

3.3Tet對乳腺癌MCF-7細胞中IGFBP-5表達的影響IGFs信號異常是腫瘤發(fā)生的重要原因之一。IGFBP-5對IGFs信號具有抑制作用，但IGFBP-5與乳腺癌的確切關(guān)系目前尚不十分清楚。因此，本研究擬分析Tet抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用是否與IGFBP-5有關(guān)。Fig 3A real-time PCR分析結(jié)果顯示，Tet明顯增加IGFBP-5的mRNA表達水平。Fig 3B Western blot結(jié)果也顯示，Tet可增加IGFBP-5的蛋白水平。結(jié)果提示，Tet抑制MCF-7細胞增殖的作用可能與其上調(diào)IGFBP-5表達有關(guān)。

3.4IGFBP-5對Tet抑制MCF-7細胞增殖作用的影響由于Tet在MCF-7細胞中明顯促進IGFBP-5表達，提示Tet對MCF-7細胞的增殖抑制作用可能與IGFBP-5有關(guān)。Fig 4 CCK-8檢測結(jié)果顯示，高表達IGFBP-5能抑制MCF-7細胞增殖，并明顯增強Tet對該細胞增殖的抑制作用；沉默IGFBP-5能促進MCF-7細胞增殖，同時減弱Tet對MCF-7細胞的增殖抑制作用。結(jié)果提示，IGFBP-5與Tet 抑制MCF-7細胞增殖有關(guān)，但具體分子機制尚不清楚。

3.5IGFBP-5在MCF-7細胞中對p53信號的影響p53作為重要的腫瘤抑制因子，是抗腫瘤藥物的重要靶點之一。因此，Tet對MCF-7細胞的增殖抑制作用可能也與p53有關(guān)。Western blot分析結(jié)果顯示，Tet明顯增加p53的蛋白水平，同時降低MDM2的水平(Fig 5A)。提示Tet抑制MCF-7細胞增殖可能與增加p53信號的功能有關(guān)，但Tet調(diào)節(jié)p53的機制尚不清楚。進一步分析結(jié)果表明，高表達IGFBP-5能增強Tet對p53表達的促進和對MDM2表達的抑制作用(Fig 5B)。以上實驗結(jié)果提示，Tet對MCF-7細胞的增殖抑制作用可能與其上調(diào)IGFBP-5表達，進而增強p53信號的功能有關(guān)。

4 討論

乳腺癌是最常見的侵襲性腫瘤之一，嚴重威脅女性健康。乳腺癌的治療包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等。近年來，乳腺癌的發(fā)生呈上升趨勢，但隨著早期篩查和診斷技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的治愈率有較大的提高。盡管如此，乳腺癌的預后仍不樂觀，如何有效改善乳腺癌的預后仍面臨巨大的挑戰(zhàn)[8]。天然藥物在腫瘤治療的過程中發(fā)揮著重要作用，越來越多從天然藥物來源的單體化合物被證明具有較好的抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)， Tet能明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖，這種作用可能與Tet通過促進IGFBP-5表達而增強p53信號的功能有關(guān)。

Fig 2 Effects of Tet on apoptosis in MCF-7 cells

A:Flow cytometric analysis results showed the effect of Tet on apoptosis in MCF-7 cells. B：Western blot assay results showed the effect of Tet on the level of Bad and Bcl-2 in MCF-7 cells.

Fig 3 Effects of Tet on IGFBP-5 in MCF-7 cells

A:Real-time PCR assay results showed the effect of Tet on the expression of IGFBP-5 in MCF-7 cells (*P<0.05,**P<0.01vscontrol). B：Western blot assay results showed the effect of Tet on the level of IGFBP-5 in MCF-7 cells.

Fig 4 Effects of IGFBP-5 on the anti-proliferation effect of Tet in MCF-7 cells

CCK-8 assay results showed the effect of over-expression or knockdown IGFBP-5 on Tet-induced proliferation inhibition effect in MCF-7 cells (*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsgroup treated with Tet alone).

Tet是從防己科植物粉防己干燥根中提取的一種二芐基異喹啉類生物堿。Tet因具有多種藥理作用，在臨床上可用于關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、消化系統(tǒng)疾病的治療[9]。研究表明，Tet還具有抗腫瘤作用，對多種腫瘤細胞具有明顯增殖抑制和促進凋亡作用，如結(jié)腸癌、肝癌等[1-3]。本研究結(jié)果也顯示，Tet對乳腺癌MCF-7細胞的增殖具有明顯抑制作用，并能誘導其凋亡。因此， Tet可能對乳腺癌具有潛在的治療效果。研究表明，Tet抗腫瘤作用的機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號或促進p53表達等有關(guān)[2,10]。但到目前為止，Tet抗腫瘤作用的確切機制仍不十分清楚。

Fig 5 Effects of Tet and/or IGFBP-5 on p53 and MDM2 in MCF-7 cells

A: Western blot assay results showed the effect of Tet on the level of p53 and MDM2 in MCF-7 cells. B: Western blot assay results showed the effect of Tet and/or over-expression of IGFBP-5 on the level of p53 and MDM2 in MCF-7 cells.

IGFs信號對細胞增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，IGFs信號與胚胎及個體發(fā)育，以及腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān)。該信號主要包括2種多肽生長因子配體(IGF-1和IGF-2)，與IGFs結(jié)合的2種受體(IGF-1受體和IGF-2受體)，7種能與IGFs結(jié)合的蛋白(IGFBP1-7)，以及一系列參與降解IGFBPs的蛋白酶，該信號異常與多種腫瘤密切相關(guān)[11]。IGFBP-5作為一種IGFs結(jié)合蛋白，對IGF信號具有調(diào)控作用。研究表明，IGFBP-5表達異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如骨肉瘤、肝癌、乳腺癌等[12-13]。IGFBP-5對部分腫瘤細胞生長具有抑制作用，但對另外的一些腫瘤細胞生長具有促進作用。因此，IGFBP-5對腫瘤細胞生長的影響具有雙向作用，原因可能與腫瘤細胞的微環(huán)境、細胞種類以及IGFBP-5各結(jié)構(gòu)域的功能狀態(tài)有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tet能抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖， 同時上調(diào)IGFBP-5表達；高表達IGFBP-5增強Tet對MCF-7細胞增殖的抑制作用，而沉默IGFBP-5則減弱Tet對MCF-7細胞增殖的抑制作用。提示Tet對MCF-7細胞的增殖抑制作用可能與上凋IGFBP-5表達有關(guān)，但具體機制尚不清楚。

作為一種重要的腫瘤抑制因子，p53突變或表達異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。對于p53水平較低的乳腺癌，可通過促進p53表達或抑制其降解，從而增強p53信號的功能而抑制腫瘤生長。文獻報道，LQFM064能通過p53途徑抑制MCF-7細胞增殖[15]。因此，p53可作為治療某些類型乳腺癌的靶點。Tet對MCF-7乳腺癌細胞具有明顯增殖抑制作用，而這種作用與上調(diào)IGFBP-5有關(guān)。提示，在MCF-7細胞中IGFBP-5表達水平增加可能與p53有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Tet在MCF-7細胞中明顯增加p53蛋白水平，降低MDM2的蛋白水平；高表達IGFBP-5增加p53水平，降低MDM2的水平；高表達IGFBP-5合并Tet則明顯增加Tet對p53表達的促進和對MDM2表達的抑制作用。以上結(jié)果表明，IGFBP-5對MCF-7細胞增殖的抑制作用可能與其上調(diào)p53表達有關(guān)。

綜上所述，本研究表明Tet能抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖，這種作用可能與Tet通過上調(diào)IGFBP-5表達，進而增強p53信號的功能有關(guān)。但Tet調(diào)節(jié)IGFBP-5表達及IGFBP-5調(diào)節(jié)p53的機制尚需進一步深入研究。

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