何林峰，王可欣，雷 蕾，張永健，蘇素文

(河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷和功能紊亂所致的病理性疼痛。例如三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)痛及各種損傷以及手術(shù)所致的神經(jīng)痛。臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛[1]、痛覺過敏、異常疼痛以及感覺異常。NNP目前的發(fā)病機制尚不明確，但廣泛認(rèn)同的機制為沿感覺神經(jīng)纖維的脈沖產(chǎn)生異常(受傷的和相鄰非受傷的感覺神經(jīng)元可以產(chǎn)生并擴布它們的興奮性變化，產(chǎn)生類似起搏器樣電位，隨之發(fā)生異位自發(fā)性放電)。NPP的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，尋找新型高效的治療措施是目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點[2]。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)在軀體痛覺感受的傳遞過程中起著非常重要的作用。它是初級傳入神經(jīng)元細(xì)胞的聚集處，是痛覺傳向中樞的第一站，也是機體內(nèi)外環(huán)境鏈接的紐帶[3]。阻斷疼痛在DRG的傳遞可能是發(fā)展新型鎮(zhèn)痛藥物的一個靶點，然而，目前這方面的研究尚少。

阿霉素(doxorubicin，DOX)是臨床常用的抗惡性腫瘤藥物，然而，DOX具有廣泛的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性作用。如大鼠腹腔注射DOX，可產(chǎn)生類似局麻樣作用，使動物的外周神經(jīng)痛覺減退，高劑量可使動物的運動功能喪失[4]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，將DOX注射于外周神經(jīng)干內(nèi)，利用其逆行性軸漿運輸和特異性聚集于感覺神經(jīng)元的特性，可用于外周神經(jīng)病理性疼痛和肌痙攣的治療，療效確切可靠[5]。此外，有研究將DOX應(yīng)用于頸椎和胸椎旁神經(jīng)阻滯治療頑固性帶狀皰疹后遺癥和癌性疼痛，均取得較為滿意的結(jié)果，且未發(fā)現(xiàn)有運動神經(jīng)的損傷[6]。目前，“影像引導(dǎo)下阿霉素背根神經(jīng)節(jié)介入治療神經(jīng)病理性疼痛”技術(shù)在臨床已廣泛應(yīng)用，但對于其導(dǎo)致神經(jīng)損傷進(jìn)而治療NPP的分子機制尚不清楚[7]。本研究采用結(jié)扎大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)建立大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察靜脈給予臨床常用劑量的DOX對疼痛的治療作用及其在DRG的聚集情況，并從DRG細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及凋亡蛋白的角度對其機制進(jìn)行初步分析。該研究可初步探明DOX治療NPP的分子機制，為臨床該藥物的合理應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級成年♂ SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g, 由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：1503127，動物使用許可證號：SCXK(冀)2013-2-001。

1.2藥物、試劑與儀器阿霉素(海正輝瑞制藥有限公司)；FCS(冰凍切片化合物，德國Leica公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；Bax、Bcl-2抗體(美國Abcam公司)；PKCɑ、PKCδ、PKCε抗體(美國BD公司)；兔及鼠熒光二抗(美國Rockland公司)；凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(北京君意東方電泳設(shè)備公司)；紫外可見分光光度計(美國NanoDrop公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Gene Company Limited)；研究級熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；熱痛儀(泰盟科技有限公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)。

1.3大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(chronicconstrictioninjuryofsciaticnerve，CCI)模型的建立及實驗分組將60只大鼠隨機分為4組：A組(假手術(shù)組，Sham)、B組(CCI手術(shù)模型組，Model)、C組(假手術(shù)+阿霉素5 mg·kg-1組，Sham+DOX)、D組(CCI手術(shù)模型+阿霉素5 mg·kg-1組，Model+DOX)，每組均15只。大鼠CCI手術(shù)模型參照Bagriyanik等[8]方法結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)制得，假手術(shù)組僅暴露但不結(jié)扎。分別在手術(shù)后d 1、3、5、7采用Von Frey纖維刺痛針法測定大鼠的機械痛閾值，采用熱痛儀測定大鼠的熱痛閾值。在手術(shù)后d 8，C組和D組均尾靜脈注射DOX(5 mg·kg-1)，其余2組給予等量生理鹽水。給藥后d 1、3、6分別采用同法測定大鼠的機械痛及熱痛閾值，觀察DOX對動物痛覺行為的影響。

1.4行為學(xué)測試

1.4.1機械刺激縮爪閾值測試 用標(biāo)準(zhǔn)Von Frey纖維針刺激小鼠右爪的掌心，從克數(shù)最小的纖維針開始，將纖維針抵住掌心并使之微微彎曲，以小鼠突然抬足或添足現(xiàn)象為出現(xiàn)疼痛反應(yīng)(陽性)。間隔5～10 min，重復(fù)測試5次，其中出現(xiàn)3次相同結(jié)果(陽性或陰性)為判定標(biāo)準(zhǔn)。記錄出現(xiàn)回縮反應(yīng)時所使用纖維針的克數(shù)作為機械縮爪反應(yīng)的閾值。

1.4.2熱刺激爪縮回潛伏時間 用熱痛儀的紅外聚光燈照射大鼠右側(cè)后足足底。記錄大鼠足爪回縮時間。連續(xù)3次，每次間隔5～10 min，取其平均值作為其熱痛閾值。

1.5背根神經(jīng)節(jié)的提取在行為學(xué)檢測結(jié)束后，也就是手術(shù)后d 15提取各組大鼠的DRG神經(jīng)節(jié)。將大鼠腰部棘突向下各數(shù)1段關(guān)節(jié)處剪斷，剪掉棘突兩側(cè)的肌肉組織和肋骨，將腰4、5段脊椎取出。沿椎管將脊椎剪開，取出L4-5DRG。

1.6DRG樣本的處理

1.6.1冰凍切片的制備 每組隨機提取3只大鼠右側(cè)L4-5DRG。將L4-5DRG用0.67 mol·L-1多聚甲醛固定24 h。0.88 mol·L-1蔗糖溶液脫水12 h。PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min，之后包埋于冰凍切片化合物中4℃過夜。d 2轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中速凍。將速凍后的DRG取出，用冰凍切片機進(jìn)行切片，切片厚度為6 μm。熒光顯微鏡下觀察DOX熒光的分布情況。

1.6.2石蠟切片的制備及HE染色 每組隨機提取3只大鼠右側(cè)L4-5DRG。放入3.33 mol·L-1甲醛溶液，固定24～72 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。采用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm。蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.6.3電鏡切片的制備 每組隨機提取3只大鼠右側(cè)L4-5DRG。將DRG組織塊置于0.25 mol·L-1戊二醛中，進(jìn)行前固定，4℃冰箱放置2～4 h。磷酸緩沖液清洗3次，每次10～15 min。1%四氧化鋨中后固定1～2 h，4℃冰箱保存。再次用磷酸緩沖液清洗3次，每次10～15 min。梯度丙酮脫水，每種濃度處理 10～15 min，然后再用17.24 mol·L-1的丙酮脫水2次，每次10～15 min。包埋劑將樣品包埋于膠囊或包埋板里。經(jīng)聚合后，用超薄切片機將樣品切成厚約50 nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛等進(jìn)行電子染色，透射電鏡觀察照相。

1.6.4DRG組織蛋白的提取 將DRG組織用磷酸鹽緩沖液漂洗10 min，重復(fù)3次。單個DRG加入400 μL RIPA裂解液和4 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)，高通量組織研磨機中將DRG破碎。4℃裂解40 min。4℃，12 000 r·min-1離心30 min，取上清，-80℃保存。

1.7Westernblot檢測對提取的DRG組織蛋白用ND-2000C紫外可見分光光度計進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后-80℃冰箱保存。SDS-PAGE方法分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印完畢后，將PVDF膜浸泡于50 g·L-1脫脂奶粉溶液中封閉(室溫?fù)u床上搖動2 ～ 3 h)。4℃ 孵育一抗過夜，次日TBST洗膜3次，每次10 min。避光室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。條帶用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描并分析。

2 結(jié)果

2.1DOX在DRG中的熒光表達(dá)在激發(fā)光源波長為488 nm的氬離子激光下，DOX組出現(xiàn)明顯的紅色熒光，而對照組未見明顯的熒光(Fig 1)。

Fig 1 Fluorescence imaging of DOX in DRG

A: Sham (×100); B: Sham (×200); C: Sham+DOX (×100); D: Sham+DOX (×200)

2.2DOX對CCI模型大鼠機械痛閾和熱痛閾值的影響與Sham組相比，Sham+DOX組在整個實驗期間機械痛域值和熱痛閾值均未見明顯改變, 而Model組大鼠于術(shù)后d 7對機械性疼痛和熱痛的敏感性均增加，表現(xiàn)為痛閾值的降低，并且在之后的觀察期持續(xù)存在(P<0.01或P<0.05)，提示CCI模型的成功建立。手術(shù)后d 8給予DOX，與Model組相比，Model+DOX組在給藥后的d 1、3、6，大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值均明顯回升(P<0.01或P<0.05)，見Fig 2、3。

2.3DOX對CCI模型大鼠DRG細(xì)胞形態(tài)的影響如Fig 4所示，Sham組細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊；Model組細(xì)胞輕度腫脹，排列整齊；Sham+DOX組細(xì)胞間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)皺縮，部分細(xì)胞可見核固縮或核溶解；Model+DOX組胞質(zhì)嚴(yán)重皺縮，部分細(xì)胞可見核固縮或核溶解。

Fig 2 Effect of DOX on mechanical pain threshold in CCI model rats (n=15)

**P<0.01vsSham group;#P<0.05,##P<0.01vsModel group

Fig 3 Effect of DOX on heat pain threshold in CCI model rats (n=15)

*P<0.05,**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsModel group

Fig 4 Effects of DOX on DRG cell morphology in CCI model rats under light microscope (×400)

A: Sham; B:Model; C: Sham+DOX; D: Model+DOX

2.4DOX對CCI模型大鼠DRG細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響如Fig 5所示，Sham和Model組細(xì)胞的核膜完整，未發(fā)現(xiàn)固縮現(xiàn)象；Sham+DOX組細(xì)胞核膜彎曲，不規(guī)則變形，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，線粒體結(jié)構(gòu)致密、空泡化，線粒體內(nèi)部絲樣化結(jié)構(gòu)增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；Model+DOX組細(xì)胞的核膜彎曲，有核固縮現(xiàn)象，線粒體嵴和膜融合或消失，排列紊亂，有的空泡形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。

2.5DOX對CCI模型大鼠Bax/Bcl-2的影響Fig 6 Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比較，Model組Bax/Bcl-2未見明顯變化，而Sham+DOX組Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.05或P<0.01)。相較于Model組，Model+DOX組的Bax/Bcl-2值明顯增高(P<0.05)。

Fig 5 Effect of DOX on DRG cell ultrastucture in CCI rats under electron microscopy(×15 000)

A: Sham; B: Model; C: Sham+DOX; D: Model+DOX

Fig 6 Effect of DOX on Bax/Bcl-2 in CCI model rats(n=6)

A: Western blot results; B: Bax/Bcl-2 gray value.*P<0.05vsSham group;#P<0.05vsModel group

2.6DOX對CCI模型大鼠PKCɑ、PKCδ、PKCε蛋白表達(dá)的影響如Fig 7所示，PKCɑ在4組中的表達(dá)無明顯變化。與Sham組相比，Model組的PKCδ和PKCε的表達(dá)無明顯變化，而Sham+DOX組的表達(dá)量則明顯降低(P<0.01)。相較于Model組，Model+DOX組PKCδ和PKCε的蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。

3 討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者深入研究了DOX對外周感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)DOX可被神經(jīng)元軸突末梢吸收，并通過軸漿逆向轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元的胞體，起到化學(xué)切除神經(jīng)節(jié)的作用。DOX可進(jìn)入神經(jīng)節(jié)細(xì)胞導(dǎo)致核孔及核孔復(fù)合體(nuclearpore complex, NPC)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng)DOX進(jìn)入神經(jīng)核之后，一方面核孔發(fā)生變化，這是引起感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化的主要原因；另一方面， NPC 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變影響到細(xì)胞核及核仁的功能，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)合成功能障礙，最終導(dǎo)致感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡[9]。但目前關(guān)于DOX神經(jīng)毒性機制方面的基礎(chǔ)研究尚少。

Fig 7 Effect of DOX on expressions of PKCɑ, PKCδ, PKCε protein in CCI model rats(n=6)

A: Western blot results; B: PKCα/β-actin, PKCδ/β-actin and PKCε/β-actin gray value.**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsModel group.

對DRG組織的熒光分析表明，阿霉素可聚集于DRG。這可能和阿霉素可破壞感覺神經(jīng)節(jié)周圍毛細(xì)血管，使其滲透性增加有關(guān)。周圍神經(jīng)系統(tǒng)微血管及神經(jīng)束膜是外界物質(zhì)進(jìn)入的屏障，外周感覺神經(jīng)節(jié)的血管滲透性很高，DOX可輕易通過血-神經(jīng)屏障進(jìn)入并損害神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[10]。我們的結(jié)果也提示，DOX有快速逆行性軸漿運輸?shù)奶匦?，靜脈注射可逆向轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元胞體，損害胞體的正常結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果和文獻(xiàn)報道的一致[11]。這種破壞作用使神經(jīng)細(xì)胞與其支配的靶細(xì)胞之間的信息傳遞和功能調(diào)控能力逐漸喪失。同時影響神經(jīng)細(xì)胞代謝，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死[12]。臨床上，DOX這種治療NPP的自殺性軸漿運輸作用稱為“逆行性感覺神經(jīng)節(jié)切除術(shù)”。有研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素單次靜脈注射5 mg·kg-1，背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，而單次劑量達(dá)到10 mg·kg-1可能會出現(xiàn)明顯的臨床外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀[13]。為了保證達(dá)到鎮(zhèn)痛效果的同時，對神經(jīng)造成最小的傷害，本實驗選用的尾靜脈注射的劑量為5 mg·kg-1。

對凋亡蛋白的分析表明，阿霉素可導(dǎo)致DRG組織Bax/Bcl-2的升高，提示阿霉素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同樣的結(jié)果在心肌細(xì)胞也得到證實。這可能與阿霉素可增加DRG組織凋亡蛋白p53和Bax的表達(dá)，增加神經(jīng)細(xì)胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)。PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的作用，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)。PKC分為傳統(tǒng)PKC(conventional PKC, cPKC，α、βI、βII、γ)、新型 PKC(novel PKC, nPKC,δ、ε、η、θ)和不典型PKC(aPKC,ξ、λ)。其中，PKCα、PKCδ及PKCε在神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PKC抑制劑可促進(jìn)TNF和其受體的結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示在TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中PKC是一個負(fù)調(diào)控因子[14-15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，DOX可下調(diào)PKCδ和PKCε的表達(dá)，而對PKCα未見明顯影響，提示PKC對凋亡蛋白的調(diào)節(jié)具有亞型特異性。我們的實驗也提示，DOX有類似于PKC抑制劑的作用，可明顯減少PKCδ和PKCε的表達(dá)。

綜上所述，DOX靜脈給藥可蓄積于DRG組織中，明顯減輕CCI大鼠的疼痛反應(yīng)，這一作用與其可降低PKCδ、PKCε的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)DRG凋亡有關(guān)。

[1] Galuppo M, Giacoppo S, Bramanti P, et al. Use of natural compounds in the management of diabetic peripheral neuropathy[J].Molecules, 2014,19(3):2877-95.

[2] Li C X, Ma G Y, Guo M F, et al. Sialic acid accelerates the electrophoretic velocity of injured dorsal root ganglion neurons[J].NeuralRegenRes, 2015,10(6):972-5.

[3] Liu S, Shi Q, Zhu Q, et al. P2X7 receptor of rat dorsal root ganglia is involved in the effect of moxibustion on visceral hyperalgesia[J].PurinergicSignal, 2015,11(2):161-9.

[4] Matouk A I, Taye A, Heeba G H, et al. Quercetin augments the protective effect of losartan against chronic doxorubicin cardiotoxicity in rats[J].EnvironToxicolPharmacol, 2013,36(2):443-50.

[5] Sturgeon K, Schadler K, Muthukumaran G, et al. Concomitant low-dose doxorubicin treatment and exercise[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol, 2014,307(6):685-92.

[6] Ammar A S, Mahmoud K M. Does the addition of magnesium to bupivacaine improve postoperative analgesia of ultrasound-guided thoracic paravertebral block in patients undergoing thoracic surgery[J].JAnesth, 2014,28(1):58-63.

[7] Naik A K, Latham J R, Obradovic A, et al. Dorsal root ganglion application of muscimol prevents hyperalgesia and stimulates myelin protein expression after sciatic nerve injury in rats[J].AnesthAnalg, 2012,114(3):674-82.

[8] Bagriyanik H A, Ersoy N, Cetinkaya C, et al. The effects of resveratrol on chronic constriction injury of sciatic nerve in rats[J].NeurosciLett, 2014,561:123-7.

[9] Purdie L, Alexander C, Spain S G, et al. Influence of polymer size on uptake and cytotoxicity of doxorubicin-loaded DNA-PEG conjugates[J].BioconjugChem, 2016,27(5):1244-52.

[10] Chun-jing H, yi-ran L, hao-xiong N. Effects of dorsal root ganglion destruction by adriamycin in patients with postherpetic neuralgia[J].ActaCirBras, 2012,27(6):404-9.

[11] Kaminskas L M, McLeod V M, Kelly B D, et al. Doxorubicin-conjugated PEGylated dendrimers show similar tumoricidal activity but lower systemic toxicity when compared to PEGylated liposome and solution formulations in mouse and rat tumor models[J].MolPharm, 2012,9(3):422-32.

[12] Hassan M, Selim ovic D, Hanning M, et al. Endoplasmic reticulum stress-mediated pathways to both apoptosis and autophagy: significance for melanoma treatment[J].WorldJExpMed, 2015,5(4):206-17.

[13] 楊 宇, 劉 慶. 阿霉素治療神經(jīng)病理性疼痛的進(jìn)展[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2008,19(10): 133-4.

[13] Yang Y, Liu Q. The progress of doxorubicin in the treatment of neuropathic pain[J].HainanMed, 2008,19(10):133-4.

[14] 湯 雷, 胥甜甜, 易小清, 等. PKCε信號通路介導(dǎo)的葛根素抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用[J]. 中國藥理學(xué)通報，2014,30(1): 77-81.

[14] Tang L, Xu T T, Yi X Q, et al. PKCε signaling pathway mediated by puerarin anti-cardiomyocyte hypoxia/reoxygenation injury[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(1): 77-81.

[15] Morioka N, Yoshida Y, Nakamura Y, et al. The regulation of exon-specific brain-derived neurotrophic factor mRNA expression by protein kinase C in rat cultured dorsal root ganglion neurons[J].BrainRes, 2013,1509:20-31.