彭文婷，孫嫵弋，孫家昌，杜佳佳，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的腫瘤之一。2015年，中國超過30萬人死于HCC，其致死率在腫瘤相關(guān)死亡病例中位居第2位，僅次于肺癌，嚴(yán)重危害了人類的生活質(zhì)量和生命健康[1]。盡管診療水平不斷提高，手術(shù)切除仍是HCC治療的主要手段，HCC患者術(shù)后5年的生存率有所提高，但是術(shù)后癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移仍是HCC預(yù)后的重要影響因素[2]。HCC的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，它涉及大量基因異常表達(dá)以及相關(guān)信號通路的異常。腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的主要途徑就是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，其主要的特征表現(xiàn)為上皮型標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的缺失或下調(diào)，以及間質(zhì)型標(biāo)志物如神經(jīng)-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的獲得和上調(diào)[3-4]。目前，用于抗肝癌藥物反應(yīng)性較低，易產(chǎn)生抗藥性，且藥物毒性大，HCC的預(yù)后仍不樂觀，如何有效改善HCC的預(yù)后仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。越來越多研究提示，天然藥物來源的單體化合物在腫瘤的治療上可能具有重要前景[5]。

人參皂苷CK(ginsenoside metabolite compound K) 結(jié)構(gòu)見Fig 1，是天然二醇型人參皂苷(如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc等)在人腸道細(xì)菌作用下的主要降解產(chǎn)物，根據(jù)皂苷元母核，其結(jié)構(gòu)屬四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型人參皂苷，是人參皂苷在體內(nèi)吸收和發(fā)揮活性作用的主要形式，具有抗炎、保護(hù)肝臟、減輕骨髓抑制、改善免疫功能等藥理活性[6]。有研究表明，人參皂苷CK通過抑制PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路，抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[7]。另外，人參皂苷CK可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)p53蛋白表達(dá)和降低Bcl-2/Bax比例有關(guān)[8]。然而，人參皂苷CK對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)探討人參皂苷CK對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移及侵襲能力的影響，并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。

Fig 1 Chemical structural formula of ginsenoside CK

1 材料

1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞HepG2由本實(shí)驗(yàn)室凍存。于37℃水浴中復(fù)蘇，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入適量含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2藥物與試劑DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)高糖培養(yǎng)基：美國Gibco公司；人參皂苷CK：分子質(zhì)量622.18，由浙江海正制藥有限公司提供，用PBS溶解，用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度；MTT： Sigma公司；Matrigel基質(zhì)膠：美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、Western一抗、二抗稀釋液、胰蛋白酶：江蘇碧云天公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：美國Thermo公司；抗p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、N-cadherin、E-cadherin抗體：美國Cell Signaling Technology公司；抗β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：美國Pierce Biology公司。

1.3儀器潔凈工作臺：江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；Powerpac164-5070電泳儀：美國Bio-Rad公司；LAS4000Mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀：美國GE公司；BX53正置顯微鏡、IX-71 熒光倒置顯微鏡：日本Olympus光學(xué)工業(yè)株氏會社產(chǎn)品。

2 方法

2.1MTT法檢測細(xì)胞活力將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并計數(shù), 使細(xì)胞數(shù)約為5×107·L-1，接種于96孔板，每孔加200 μL細(xì)胞懸液；放置在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中；待細(xì)胞貼壁后，在96孔板中加入不同濃度人參皂苷CK(0、10、20、40、80 μmol·L-1)，每組6個復(fù)孔，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出96孔板，每孔加入20 μL濃度為5 g·L-1的MTT溶液；放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h；培養(yǎng)結(jié)束后吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，避光，在水平振蕩儀上震動10 min；用酶標(biāo)儀檢測各組在490 nm處的OD值，繪出細(xì)胞活力柱狀圖。

2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種于6孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為1×106個；放置在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中；待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞匯合度約為80%時，換為無血清的DMEM培養(yǎng)，每孔用槍頭劃出3道豎線，在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍攝各孔細(xì)胞0 h時，細(xì)胞劃痕的初始狀態(tài)；之后在6孔板中加入不同濃度的人參皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h時后取出，在光學(xué)顯微鏡下拍攝各組細(xì)胞劃痕的狀態(tài)。計算細(xì)胞24 h遷移率。遷移率=(劃痕面積0 h- 劃痕面積24 h)/劃痕面積0 h

2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力將Transwell小室放于24孔板中，在Transwell下室中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，并分別加入不同濃度的人參皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)；將Matrigel膠放入冰箱中隔夜使其解凍，在Transwell小室表面鋪100 μL用DMEM稀釋的Matrigel，放在培養(yǎng)箱中孵育2 h，使形成一層基質(zhì)屏障膜；將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種于Transwell小室，每孔細(xì)胞數(shù)約為2×104個，細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h；取出Transwell小室，PBS輕輕漂洗2遍，用結(jié)晶紫染色；PBS沖洗，Transwell上室中未遷移的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去；在倒置顯微鏡下觀察，對膜底細(xì)胞進(jìn)行拍照、計數(shù)、統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4Westernblot實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×106個；待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)至80%融合后，換無血清培養(yǎng)基同步化；之后在6孔板中加入不同濃度的人參皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次；加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁細(xì)胞，吸至EP管中，4 ℃、15 000 r·min-1離心15 min，吸取上清得到細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；用含0.05%吐溫20的PBS(TPBS)配制5%脫脂奶粉，封閉PVDF膜，放置于37°C搖床中2 h；將PVDF膜加入按1 ∶1 000稀釋的β-actin、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、E-cadherin、N-cadherin抗體中，4 ℃搖床孵育過夜；加入按適當(dāng)比例稀釋后的二抗，37 ℃孵育2 h；將ECL顯影液(A液 ∶B液=1 ∶1)均勻涂布于膜上條帶相應(yīng)位置，于LAS4000Mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀中曝光；采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析，測得條帶的灰度值，計算各組的目的條帶和內(nèi)參的比值，比較各組間差異。

3 結(jié)果

3.1人參皂苷CK抑制肝癌細(xì)胞的活力Fig 2 MTT結(jié)果顯示，不同濃度的人參皂苷CK作用后，與對照組(0 μmol·L-1人參皂苷CK)相比，10 μmol·L-1人參皂苷CK組HepG2細(xì)胞活力并無明顯變化。人參皂苷CK濃度增加至 20～80 μmol·L-1時，人肝癌細(xì)胞HepG2的活力受到明顯抑制。

Fig 2 Effect of ginsenoside CK on viability of

**P<0.01vscontrol group

3.2人參皂苷CK抑制肝癌細(xì)胞的遷移使用細(xì)胞劃痕法檢測人參皂苷CK對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移能力的影響。與對照組(0 μmol·L-1人參皂苷CK)相比，人參皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)能明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的遷移(Fig 3)。

3.3人參皂苷CK抑制肝癌細(xì)胞的侵襲Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 4)，與對照組(0 μmol·L-1人參皂苷CK)相比，人參皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的穿膜細(xì)胞數(shù)。提示人參皂苷CK能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲。

3.4人參皂苷CK對HepG2細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響EMT在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用。通過EMT進(jìn)程，細(xì)胞獲得較高的遷移、侵襲和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。Western blot結(jié)果顯示(Fig 5)，與空白對照組相比較，HepG2 細(xì)胞中N-cadherin蛋白表達(dá)水平隨給藥濃度增高而下降，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平逐漸升高。結(jié)果提示人參皂苷CK可能調(diào)控人肝癌HepG2細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

3.5人參皂苷CK對HepG2細(xì)胞中ERK、Akt信號的影響Western blot檢測顯示(Fig 6)，與空白對照組相比較，人參皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)作用于HepG2細(xì)胞24 h后，ERK、Akt蛋白的表達(dá)無明顯變化，而p-ERK、p-Akt的表達(dá)明顯降低，p-ERK/ERK、p-Akt/Akt的比值明顯降低。提示人參皂苷CK可抑制ERK、Akt的磷酸化。

4 討論

HCC初期病情隱匿，無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀前來就診者，其病程大多已進(jìn)入中晚期。這個階段的HCC，癌細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)多個病灶。目前，除手術(shù)切除和化藥輔助治療外，HCC治療領(lǐng)域缺少療效好、副作用小的治療藥[9]。相關(guān)研究表明，人參皂苷CK能抑制人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT-116的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也能抑制鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的轉(zhuǎn)移[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK可抑制HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與抑制ERK和Akt信號，負(fù)性調(diào)節(jié)EMT有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性，脫離原發(fā)灶形成游離細(xì)胞，而EMT在此過程中發(fā)揮了重要的作用。EMT現(xiàn)象被認(rèn)為是影響肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。上皮細(xì)胞通過發(fā)生EMT，獲得成纖維樣細(xì)胞的特征，包括細(xì)胞形態(tài)改變、黏附減弱、細(xì)胞活性增強(qiáng)。通常當(dāng)E-cadherin表達(dá)缺失，腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)灶形成游離細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞原位浸潤性及遷移游走[12]。

A: Cell wound healing assay was used to detect effect of ginsenoside CK on migration of HepG2 cells; B: Quantitative analysis showed the percentage wound closure relative to different groups using Adobe Photoshop Elements 6.0 software.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

A: Cell transwell assay was applied to detect effect of ginsenoside CK on cell invasion of HepG2 cells; B: Quantitative analysis showed the number of cells on transwell chamber membrane.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 5 Effect of ginsenoside CK on marker of EMT(±s, n=3)

A: Western blot of N-cadherin and E-cadherin expression in HepG2 cultured with ginsenoside CK at the various concentrations; B: The semi-quantitative analysis of N-cadherin and E-cadherin expression in various groups. The band intensity of N-cadherin and E-cadherin was quantified by densitometry and normalized to β-actin.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

N-cadherin在EMT過程中表達(dá)增加。與E-cadherin不同，在間質(zhì)型細(xì)胞中，N-cadherin加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動和轉(zhuǎn)移的能力，并且其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲作用可超過介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用[13]。因此，EMT與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象時，腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低，而N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)抑制了HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲能力；與對照組(0 μmol·L-1人參皂苷CK)相比，人參皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)作用的HepG2細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平下降。提示人參皂苷CK可能調(diào)控的人肝癌HepG2細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

目前，已知的誘導(dǎo)和調(diào)控EMT的因素很多，其信號調(diào)控是個十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。ERK1/2及PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要通路，而這些通路的持續(xù)活化與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，PI3K/Akt、ERK通路過度活化會促進(jìn)HCC的EMT進(jìn)程[16-17]。目前，尚不清楚人參皂苷CK是否能通過ERK、PI3K/Akt通路參與調(diào)控EMT進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)通過檢測人參皂苷CK不同濃度給藥組ERK、Akt通路蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK能降低p-ERK/ERK和p-Akt/Akt的比值。由此推測，人參皂苷可能通過抑制ERK和Akt信號通路，負(fù)性調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

Fig 6 Effect of ginsenoside CK on expression of p-Akt and p-ERK proteins(±s, n=3)

A: Western blot of p-Akt and p-ERK expression in HepG2 cultured with ginsenoside CK at the various concentrations; B: The semi-quantitative analysis of p-Akt and p-ERK expression in various groups. The band intensity of p-Akt/Akt and p-ERK/ERK was quantified by densitometry.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

綜上所述，人參皂苷CK可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程，可能與抑制ERK和Akt信號有關(guān)。這些初步研究為人參皂苷CK后期的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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