蔡鳳桃，張學(xué)榮，孫 林，王秀男，廖 明，班建東，陳 纓，農(nóng) 君

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 蛇毒研究所、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，是肝臟對于各種慢性刺激損傷進(jìn)行自我修復(fù)的一種病理過程，最終可能發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭等肝臟疾病。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是細(xì)胞合成并分泌到胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞間的大分子，其增生與降解失衡可導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)作為肝臟組織中ECM的主要合成細(xì)胞，其增殖與凋亡直接影響肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[1]。近期有研究表明，HSC在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinnoma，HCC) 的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能至關(guān)重要，被激活的HSC可以異常分泌一些細(xì)胞因子，如IL-8、FGF1/2、PDGF、IGF等，此類因子會促進(jìn)HCC的進(jìn)展[2-3]。因此，誘導(dǎo)HSC凋亡、抑制其增殖成為預(yù)防和治療肝纖維化、肝癌和一些其他肝臟疾病的一個重要途徑，對HSC凋亡機(jī)制的研究也顯得尤為重要[4]。PI3K/Akt作為大鼠HSC中的重要信號通路已被證明可通過控制其上游或下游蛋白，影響細(xì)胞增殖與凋亡[5]。研究表明[6-7]，硫化氫、氧化氮類化合物以及神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，抑制大鼠HSC的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而對肝纖維化發(fā)揮良好的干預(yù)作用。NGF作為近年來發(fā)現(xiàn)的HSC凋亡誘導(dǎo)劑，已在肝纖維化的研究中引起廣泛重視[8-9]。本實(shí)驗室從眼鏡蛇毒中提取NGF，得率高、純度高、方法簡單。并且前期實(shí)驗證實(shí)，NGF可通過PI3K/Akt信號通路抑制大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖，最小有效濃度為4 mg·L-1，最大抑制率約為60%。 但近年來，對人HSC的研究甚少。本研究以人HSC-LX2為研究對象，采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)和 Western blot 檢測NGF對LX2細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，以期為治療肝臟疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器人肝星狀細(xì)胞株LX2，由廣西醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室饋贈；眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子(NGF)由本實(shí)驗室提??；GAPDH抗體、Akt抗體、辣根過氧化物酶熒光標(biāo)記羊抗兔抗體、PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑 LY294002，均購自Abcam公司；Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡試劑盒(6084648)購自BD 公司；CCK-8試劑盒(KL640)購自日本同仁公司。酶標(biāo)儀(Biotek公司，型號：ELX800)；流式細(xì)胞儀(BD公司，型號：FACScalibur)。

1.2方法

1.2.1眼鏡蛇毒NGF的提取 廣西眼鏡蛇毒粗毒凍干粉溶解、離心、0.45 μm濾膜過濾，經(jīng)DEAECL-6B 陰離子交換層析柱、G-50 凝膠分子篩、MACRO-PREP HIGH S 強(qiáng)陽離子交換層析柱三步分離純化后，收集活性峰，透析、凍干，質(zhì)譜檢測，電泳鑒定，PC-12細(xì)胞活性鑒定，所得產(chǎn)物即為NGF。0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.2LX2細(xì)胞培養(yǎng) 將LX2細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后，換液處理。細(xì)胞達(dá)到90%融合度，棄去培養(yǎng)基， PBS洗細(xì)胞3次，徹底清除血清后，0.25%胰酶消化1 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；2 mL新鮮培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計數(shù)，以每孔1 000個細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中。每次實(shí)驗均在細(xì)胞指數(shù)生長期時進(jìn)行。

1.2.3實(shí)驗分組 本實(shí)驗分為空白組、實(shí)驗組(NGF組)、對照組(LY294002)。實(shí)驗組分別按照0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1濃度梯度加入NGF；對照組加入50 μmol·L-1LY294002，空白組加入等體積的PBS。

1.2.4CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)期生長期的LX2細(xì)胞，計數(shù)，以每孔1 000個細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板，共7組，每組設(shè)6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用 PBS洗3次，加入無血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，使細(xì)胞同步化。按照實(shí)驗設(shè)計及分組，加入相應(yīng)劑量的NGF/LY294002，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗3次，每孔加90 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基、10 μL CCK-8，37℃孵育2 h，待顏色變深后，酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定OD值，根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率/%=(培養(yǎng)基孔OD值-實(shí)驗孔OD值)/(對照孔OD值- 培養(yǎng)基孔OD值)×100% 。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的LX2細(xì)胞，以2×105/孔的密度接種于6 孔板，十字震蕩混勻，待細(xì)胞貼壁后，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液同步化12 h，按照實(shí)驗分組加入相應(yīng)劑量的 NGF/LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，取1×106細(xì)胞/管于流式管中。按照 Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡試劑盒說明書進(jìn)行染色，避光孵育30 min后，上機(jī)進(jìn)行流式檢測。

1.2.6Western blot分析Akt磷酸化水平 取對數(shù)生長期的LX2細(xì)胞2×105個/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓處理12 h，按不同分組分別加入 PBS、NGF (最小有效濃度)、LY294002 (50 μmol·L-1)、NGF (最小有效濃度) +LY294002(50 μmol·L-1)作用最小作用時間。處理后的LX2 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3次，每孔加入50 μL細(xì)胞裂解液(含PMSF、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10 min，13000 r·min-1離心30 min，收集上清，BCA法測蛋白濃度。以GAPDH為內(nèi)參，Western blot檢測蛋白表達(dá)量，用 ODYSSEY 系統(tǒng)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1不同處理因素對LX2細(xì)胞增殖的影響如Fig 1所示，隨著作用于細(xì)胞的NGF濃度的增大，LX2細(xì)胞增殖抑制率逐漸增大，當(dāng) NGF濃度達(dá)到 8 mg·L-1時，增殖抑制率達(dá)到平臺期，上升緩慢。其中，最小有效濃度為1 mg·L-1，當(dāng) NGF 濃度為1 mg·L-1以下時，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)NGF濃度為1 mg·L-1及以上時，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；對照組與空白組以及實(shí)驗組各濃度相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 The inhibitory rate of LX2 proliferation after treatment with different factors determined by CCK-8

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

2.2不同處理因素對LX2細(xì)胞凋亡的影響如Fig 2所示，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，在不同濃度NGF作用下，LX2細(xì)胞凋亡程度不同，且隨著NGF濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增大。經(jīng)計算，當(dāng)NGF濃度為1、8 mg·L-1時，與空白組凋亡率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3不同處理因素對p-Akt蛋白水平的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，當(dāng)加入NGF(1 mg·L-1)、LY294002 (50 μmol·L-1)后，p-Akt的表達(dá)量順序為：空白組(PBS)>NGF組>LY294002組>NGF+LY294002組，Akt的表達(dá)量基本沒有變化。提示NGF對Akt的磷酸化具有抑制作用。

Fig 2 Apoptosis of LX2 cells underdifferent treatment factors

A: Blank group ;B: NGF 1mg·L-1; C: NGF 8mg·L-1; D: LY294002 50 μmol·L-1; E: Apoptosis rate of LX2 cells under different treatment factors.**P<0.01vsblank group

Fig 3 Phosphorylation of Akt protein in LX2 cells detected by Western blot

**P<0.01vsblank group

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的中間過程,是肝癌發(fā)展的早期表現(xiàn)，其特征為以膠原蛋白為主的ECM合成與降解失衡。因此，揭示肝纖維化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及抑制其發(fā)展，成為預(yù)防和控制肝硬化、肝癌和其他一些肝臟疾病發(fā)展的重要途徑。HSC作為產(chǎn)生ECM的關(guān)鍵細(xì)胞，減少活化HSC的數(shù)量是預(yù)防和治療肝臟疾病的有效方法[11]。研究表明，過氧化氫、硫化氫、EZH2等可通過作用于PI3K通路、TGFβ-Smad通路、ROCK通路、MAPK通路等信號通路，影響通路下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，從而對HSC的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、新血管生成以及細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控[12-13]。眼鏡蛇毒NGF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，可通過使HSC細(xì)胞周期停滯于G2期而抑制HSC增殖；經(jīng)NGF作用的大鼠HSC可出現(xiàn)明顯的增殖受抑、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，眼鏡蛇毒NGF能改變HSC-T6信號通路中某些蛋白的表達(dá)量，使HSC-T6細(xì)胞增殖受到抑制，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程。

本研究通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot等技術(shù)分別檢測了在PBS、NGF、LY294002作用下，LX2細(xì)胞增殖、凋亡和蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，眼鏡蛇蛇毒中提取的神經(jīng)生長因子NGF以不同濃度作用于LX2細(xì)胞時，均可對細(xì)胞的增殖率起到直接抑制作用，并且具有濃度依賴性，其最小有效濃度為1 mg·L-1,當(dāng)濃度為8 mg·L-1時達(dá)到平臺期，最大增殖抑制率約為63%。與張可星等[15]實(shí)驗結(jié)果(NGF抑制HSC-T6增殖的最小濃度為4 mg·L-1)相比，最小有效濃度降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，NGF促進(jìn)LX2細(xì)胞凋亡也具有一定的濃度相關(guān)性，與對照組LY294002的作用結(jié)果相比不具統(tǒng)計學(xué)意義，說明NGF可促進(jìn)LX2細(xì)胞凋亡，且與LY294002有類似作用。Western blot實(shí)驗結(jié)果表明，NGF和LY294002 均使p-Akt的表達(dá)量降低，Akt的表達(dá)量基本沒有變化，NGF能夠有效抑制 PI3K/Akt 信號通路中Akt蛋白的磷酸化，從而抑制LX2細(xì)胞的增殖，與通路抑制劑聯(lián)合使用時效果加強(qiáng)。綜合以上實(shí)驗結(jié)果，我們推論，眼鏡蛇毒NGF可抑制LX2細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與降低PI3K/Akt信號通路中Akt蛋白的磷酸化有關(guān)。PI3K/Akt信號通路與其他信號通路之間的關(guān)系，及其與各種影響因素之間的關(guān)系，也值得進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，本研究為發(fā)現(xiàn)預(yù)防及治療肝纖維化的新作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。NGF 作為重要的促HSC凋亡的物質(zhì)在眼鏡蛇毒中含量十分豐富,研究眼鏡蛇蛇毒 NGF抑制HSC增殖的機(jī)制，對闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制、尋找肝纖維化的防治藥物及臨床治療肝纖維化有著積極的意義。

(致謝：本實(shí)驗在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗中心蛇毒研究所完成，感謝各位老師和同學(xué)對實(shí)驗的指導(dǎo)與幫助！)

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