張春東，王 欣，唐 杰

(1.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院超聲科，2.兒科，河北 石家莊 050082；3.中國(guó)人民解放軍解放軍總醫(yī)院超聲科，北京 100853)

肢體擠壓傷，即使未傷及重要臟器，也可能致命。急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是擠壓傷最重要、最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]，常為最終致死原因[2]。擠壓傷后AKI發(fā)生率約0.5%～3.3%[3-4]，死亡率達(dá)15%～40%[3-5]，若合并多器官功能衰竭，感染及心、肺疾病，死亡率可高達(dá)80%[4]。AKI雖致命但卻可預(yù)防及逆轉(zhuǎn)[6]。由于擠壓傷后AKI表現(xiàn)為腎臟血液灌注不足，故對(duì)腎臟血流灌注的檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)腎損傷的指標(biāo)，超聲微泡造影劑是一種血池造影劑，可有效檢測(cè)局部組織血流灌注。本研究旨在探討定量CEUS在兔肢體肌肉擠壓傷后AKI早期診斷及監(jiān)測(cè)中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取64只新西蘭大白兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.3 kg，年齡1.0～1.5歲。所有動(dòng)物由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)72 h適應(yīng)環(huán)境。將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=56)和對(duì)照組(n=8)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 模型制備 將實(shí)驗(yàn)兔以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質(zhì)量)經(jīng)耳緣靜脈注射，于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中補(bǔ)充注射10 mg/(kg·h)以維持麻醉狀態(tài)。對(duì)實(shí)驗(yàn)兔左后肢備皮，纏以棉紗墊(5 cm×25 cm)，再將血壓計(jì)氣囊綁縛于棉紗墊外側(cè)，充氣并保持40 kPa壓強(qiáng)，加壓4 h制備肢體肌肉擠壓傷后AKI模型(圖1)。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔左側(cè)背部備皮以供腎臟超聲檢查。對(duì)照組進(jìn)行麻醉、備皮、棉紗墊及血壓計(jì)氣囊綁縛，但不加壓。

1.3 CEUS檢測(cè) 采用Philips iU22超聲診斷儀，L12-5線陣探頭，頻率5～12 MHz，配備CEUS功能及QLAB分析軟件。超聲造影劑為SonoVue(Bracco)，加入5 ml生理鹽水振蕩混勻后，按0.2 ml劑量[7]經(jīng)兔耳緣靜脈團(tuán)注，隨后跟注生理鹽水5 ml。在解除壓力后第0.5、2.0、6.0、24.0 h及3、7、14天，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)組分為7個(gè)亞組，每組8只。應(yīng)用CEUS檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔左腎，并存儲(chǔ)存動(dòng)態(tài)圖像3 min以備脫機(jī)分析。

圖1 采用球囊束帶加壓法制備新西蘭兔AKI模型及示意圖 (A：肢體；B：棉紗墊；C：球囊；D：血壓計(jì))

采用QLAB軟件分析造影圖像，在淺側(cè)腎實(shí)質(zhì)選取邊長(zhǎng)5 mm的正方形ROI，避開(kāi)較大血管走行區(qū)，軟件自動(dòng)生成時(shí)間-強(qiáng)度曲線，并計(jì)算峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)、曲線下面積(area under the curve, AUC)、升支斜率(ascending slope, AS)及降支斜率(descending slope, DS)等參數(shù)。對(duì)每只實(shí)驗(yàn)兔均檢測(cè)3次，取平均值。

1.4 組織生化檢測(cè)及病理檢測(cè) 分別采集2組各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈血2 ml，離心后取上清液檢測(cè)血清肌酸肌酶(creatine kinase, CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)及血肌酐(creatinine, Cr)，隨后經(jīng)耳緣靜脈注入空氣50 ml處死實(shí)驗(yàn)兔，即刻取腎臟組織置入10%中性福爾馬林溶液，制備病理切片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)組不同亞組和對(duì)照組生化指標(biāo)和CEUS參數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；CEUS定量參數(shù)與血生化參數(shù)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

64只實(shí)驗(yàn)兔中，3只在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡，分屬解壓后6.0、24.0 h及3天亞組，其余61只完成全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

2.1 生化檢查 實(shí)驗(yàn)組各亞組和對(duì)照組血清CK、LDH、BUN及Cr總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，解壓后2.0、6.0、24.0 h及3天亞組明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組在解壓后6.0、24.0 h亞組達(dá)峰值，解壓后7、14天亞組恢復(fù)至正常范圍，見(jiàn)表1。

2.2 CEUS結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組各亞組和對(duì)照組CEUS定量參數(shù)PI、AUC、AS及DS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.05)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各亞組AS及DS減小(P均<0.05)，但實(shí)驗(yàn)組各亞組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)組腎臟組織CEUS表現(xiàn)為PI減低，AUC增高，在解壓后6.0、24.0 h亞組達(dá)峰值，并于解壓后7、14天亞組恢復(fù)至正常范圍(表2)，時(shí)間-強(qiáng)度曲線表現(xiàn)為緩升緩降型(圖2)。

2.3 相關(guān)性分析 PI與CK(r=-0.897，P=0.003)、LDH(r=-0.811，P=0.015)、BUN(r=-0.890，P=0.003)、Cr(r=-0.916，P=0.001)及AUC(r=-0.924，P=0.001)呈負(fù)相關(guān)；AUC與CK(r=0.976，P<0.001)、LDH(r=0.867，P=0.005)、BUN(r=0.954，P<0.001)、Cr(r=0.946，P<0.001)呈正相關(guān)。

2.4 病理表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組見(jiàn)腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清楚，腎小球血管明顯淤血，并見(jiàn)部分細(xì)胞核濃縮深染，近曲小管上皮細(xì)胞輕度腫脹；部分腎小管腔內(nèi)可見(jiàn)無(wú)定形管型，皮髓質(zhì)交界腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，腔內(nèi)可見(jiàn)無(wú)定形管型，可見(jiàn)單個(gè)腎小管壞死、遠(yuǎn)曲小管上皮脫落，細(xì)胞明顯腫脹伴壞死，皮質(zhì)、髓質(zhì)間質(zhì)血管明顯淤血；病理改變?cè)诮鈮汉蟮?、24 h最明顯，見(jiàn)圖3。

3 討論

目前，主要依靠臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查診斷AKI，如檢測(cè)CK，但特異性較差，且無(wú)明確界值[8-9]。由于AKI表現(xiàn)為腎臟血液灌注不足，增強(qiáng)CT、MRI等可評(píng)價(jià)腎實(shí)質(zhì)血流灌注，但由于碘對(duì)比劑具有腎臟毒性，且大型影像設(shè)備難以進(jìn)入災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)，對(duì)急性期患者診斷價(jià)值有限；也有報(bào)道[10]認(rèn)為此類檢查對(duì)早期AKI并不敏感。超聲微泡造影劑是一種血池造影劑，可檢測(cè)局部組織血流灌注，無(wú)腎毒性，應(yīng)用廣泛[11-12]，如已應(yīng)用于肢體擠壓傷后局部肌肉損傷的定量檢測(cè)[13-15]，故可用于定量檢測(cè)AKI[16]。

表1 各組生化檢查指標(biāo)比較(±s)

表1 各組生化檢查指標(biāo)比較(±s)

組別CK(U/L)LDH(U/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)實(shí)驗(yàn)組 0.5h亞組5432.66±1061.20252.25±46.616.45±0.9960.52±3.06 2.0h亞組24232.00±1868.42530.75±80.276.92±0.7267.34±9.09 6.0h亞組43129.00±8086.72614.88±90.919.12±1.44105.06±13.69 24.0h亞組74805.57±12746.47866.00±78.3314.86±2.76132.73±22.20 3天亞組19908.43±7475.50178.57±50.9711.19±0.94106.16±11.75 7天亞組1505.88±347.43129.13±30.636.69±1.1379.90±11.69 14天亞組435.43±60.71100.57±20.265.92±0.7259.62±6.57對(duì)照組470.44±100.93117.00±37.985.69±0.2553.92±1.93F值142.58166.9147.5746.86P值<0.05<0.05<0.05<0.05

表2 各組腎臟CEUS參數(shù)比較(±s)

表2 各組腎臟CEUS參數(shù)比較(±s)

組別PI(dB)AUC(dB·s)ASDS實(shí)驗(yàn)組 0.5h亞組41.80±1.01999.38±171.432.59±0.330.04±0.01 2.0h亞組39.26±1.381142.38±135.542.16±0.210.04±0.01 6.0h亞組38.91±1.091332.13±113.352.13±0.370.04±0.01 24.0h亞組37.19±1.231678.86±214.081.97±0.350.03±0.01 3天亞組38.79±1.051247.00±148.902.13±0.240.03±0.01 7天亞組40.65±1.171068.88±115.822.37±0.350.04±0.01 14天亞組41.56±1.121001.86±126.922.56±0.420.05±0.01對(duì)照組42.33±1.01986.88±153.282.70±0.390.05±0.01F值8.3715.974.599.77P值<0.05<0.05<0.05<0.05

圖2 腎實(shí)質(zhì)定量造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線圖 A.對(duì)照組示團(tuán)注造影劑后快速達(dá)到峰值，隨后峰值強(qiáng)度降低; B.實(shí)驗(yàn)組示解壓后24.0 h時(shí)間-強(qiáng)度曲線表現(xiàn)為緩升緩降型 圖3 腎實(shí)質(zhì)病理改變 A(HE，×40)、B(HE，×20).對(duì)照組示腎皮質(zhì)髓質(zhì)分界清楚，腎小球結(jié)構(gòu)正常，遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常; C(HE，×40)、D(HE，×20).解壓后24.0 h亞組示腎小球血管淤血，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，少數(shù)細(xì)胞明顯腫脹或變性壞死脫落，部分腔內(nèi)見(jiàn)無(wú)定形管型

本研究應(yīng)用袖帶球囊加壓法[17]制備擠壓傷模型，操作簡(jiǎn)便，可準(zhǔn)確控制擠壓的壓力[18]，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及肌肉病理檢測(cè)提示此法具有較好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)擠壓傷后各定量CEUS參數(shù)有明顯變化，PI降低，AUC增大，時(shí)間-強(qiáng)度曲線表現(xiàn)為緩升緩降型。分析可能原因：首先，肢體于擠壓傷后腫脹，液體潴留于組織間隙，循環(huán)血量減少，腎血流灌注減少，故PI減小；其次，骨骼肌損傷，具有腎毒性的肌紅蛋白釋放到血液循環(huán)，使腎血管收縮，并形成結(jié)晶及管型，堵塞腎小管，使腎血液灌注進(jìn)一步減少[8]，故PI減??；由于局部肌肉溶解壞死，內(nèi)容物釋出致急性腎小管壞死，腎內(nèi)直小管維持腎髓質(zhì)高滲作用減弱消失，致腎小血管內(nèi)血流淤滯，造影微泡消退延遲[7]，時(shí)間-強(qiáng)度曲線降支平緩，故DS減小，綜合作用致AUC增大。

既往動(dòng)物研究[7]中，AKI的CEUS定量參數(shù)主要表現(xiàn)為AUC增大，而PI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本研究中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組PI減小，AUC增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能因既往為對(duì)實(shí)驗(yàn)兔后肢注射甘油制備AKI動(dòng)物模型，局部肌肉溶解壞死，內(nèi)容物釋出引起急性腎小管壞死，腎內(nèi)直小管維持腎髓質(zhì)高滲作用減弱消失，致腎小血管內(nèi)血流淤滯，造影微泡消退延遲，故DS減小，時(shí)間-強(qiáng)度曲線降支平緩，AUC增大，而局部肌肉組織并無(wú)明顯腫脹及液體潴留，循環(huán)血量無(wú)明顯減少，腎血流灌注無(wú)明顯減少，故PI無(wú)明顯減小，與本研究結(jié)果有所不同，提示CEUS可能更適用于診斷擠壓傷后AKI。

目前臨床用于診斷AKI的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要是BUN和Cr[19]，診斷肌肉損傷主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)為CK和LDH。本研究中CEUS的PI和AUC與腎臟實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性亦較好，提示CEUS可較敏感地反映實(shí)驗(yàn)兔腎臟實(shí)質(zhì)血流灌注變化，與腎損傷程度具有較好的相關(guān)性。

本研究的局限性：新西蘭兔下肢肌肉占全身的比例明顯小于人體，故肢體擠壓傷后肌體腫脹所造成的淤血及體液潴留程度所造成的影響可能較小，腎臟血流灌注減少程度和損傷程度也可能較輕，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床意義還需進(jìn)一步探討；因擠壓傷時(shí)血、尿肌紅蛋白多為一過(guò)性增高、時(shí)間窗較窄，且在災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)，醫(yī)療資源極為緊張，監(jiān)測(cè)尿量難以達(dá)到，而本研究重點(diǎn)為對(duì)兔AKI的診斷及病情監(jiān)控，故未進(jìn)行尿肌紅蛋白檢測(cè)及尿量監(jiān)測(cè)，今后研究中應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上所述，CEUS可較敏感地反映兔擠壓傷后AKI改變。

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