程禮芝，郭平霞，戴偉峰，晏永明，劉寶華，王淑美，程永現(xiàn)，*

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東 深圳 518060；3.中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；4.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，廣東 深圳 518060）

黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.為茄科枸杞屬多年生灌木，簡稱黑枸杞，果實(shí)黑色，是一種藥食兩用植物，在我國主要分布于西北地區(qū)，尤以青海產(chǎn)的質(zhì)量最優(yōu)。藏藥稱黑果枸杞為 “旁瑪”，其味甘、性平，清心熱，用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)異常、停經(jīng)等病癥，民間常生食或榨汁做飲料，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、明目及降血壓作用［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用［2-5］。其化學(xué)成分研究比較薄弱，已有研究主要集中于花色苷、原花青素、生物堿類和酚性化合物［2-8］。黑果枸杞含有豐富的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，其原花青素含量很高，是目前發(fā)現(xiàn)的天然野生果實(shí)中花青素含量最高的植物，原花青素具有很好的清除自由基和抗氧化作用，因此黑果枸杞近年來在保健品開發(fā)市場(chǎng)異?；钴S［9］，逐漸被公眾所熟知，其價(jià)格也是不斷上漲。由于野生資源的匱乏，人工栽培種植也逐漸成規(guī)模，這為充分利用這一天然資源提供了保障。鑒于此，本研究主要對(duì)黑果枸杞物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，從中共分離鑒定化合物14個(gè)，其中化合物1～4、7、9和14為首次從該植物中分離得到，并對(duì)化合物1和2進(jìn)行了抗衰老相關(guān)因子SIRT1和SIRT6的體外活性測(cè)試。

1 儀器與材料

薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；MCI gel CHP 20P（75～150μm，日本三菱公司）；Sephadex LH-20（25～100μm，Pharmacia公司）；RP-18（40～63μm，日本 Daiso）；北京創(chuàng)新通恒 LC3000型HPLC和Agilent 1200型HPLC，半制備色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5μm）和YMC-Pack-ODS-A（250 mm×10 mm，5μm）；Bruker AvanceⅢ400MHz、500MHz和Bruker Avance 600 MHz核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；PerkinElmer En-Spire型多通道酶標(biāo)儀；SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit（Enzo公司）；CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit（MEDICAL＆ BIOLOGICAL LABORATORIES，MBL公司）。

黑果枸杞樣品由青海大可生物科技有限公司提供，經(jīng)云南省藥物研究所高級(jí)工程師邱斌鑒定為黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.的干燥果實(shí)，憑證標(biāo)本（編號(hào)：CHYX0605Q）保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 提取與分離

黑果枸杞5 kg，80%乙醇水回流提?。?×2 h），每次6倍體積，提取液用鹽酸調(diào)pH為1～2，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，各3次，分別記為A和B部分。A部分（52.5 g）經(jīng)MCI gel CHP 20P柱（甲醇-水，10%～100%）分為7段（F1～F7）。F1（1.5 g）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）色譜得3個(gè)組分（F1.1～F1.3）。F1.1（500 mg）經(jīng)制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］再行半制備 HPLC［乙腈-水（含5‰甲酸），20%］得化合物8（3 mg）、2（1.1 mg）和 7（7.9 mg）。F1.2（500 mg）經(jīng)制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1））再行半制備 HPLC［甲醇-水（含5‰甲酸），45%］得化合物1（2.4 mg）和 9（3.7 mg）。F4（2.5 g）經(jīng) Sephadex LH-20（甲醇）色譜得6個(gè)組分（F4.1～F4.6）。F4.1（600 mg）經(jīng)制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.05）］得 5個(gè)組分（F4.1.1～F4.1.5），F(xiàn)4.1.4（50 mg）經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水，15%）得化合物10（2 mg）、4（4.1 mg）和3（2.5 mg）。F4.1.5（80 mg）經(jīng)半制備 HPLC（乙腈-水，20%）得化合物12（1.6 mg）、13（4.5 mg）和14（3.5 mg）。F4.3（200 mg）經(jīng)制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］，再行半制備 HPLC（乙腈-水，25%）得化合物 5（2.2 mg），6（2.4 mg）和 11（1.9 mg）。

2.2 SIRT1體外活性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)利用SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit以檢測(cè)化合物對(duì)SIRT1體外活性的影響。首先，配制含0.5 U（1 U＝1 pmol·min-1，37℃）SIRT1（除空白組外），1000μmol·L-1NAD+，100μmol·L-1去乙酰酶底物，SIRT1緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，137mmol·L-1NaCl，2.7mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，1 mg·mL-1BSA）的體系。實(shí)驗(yàn)組加入待檢測(cè)化合物，使化合物終濃度為200μmol·L-1，空白組與對(duì)照組加入等量溶解化合物的溶劑；再加入已配好的體系，使加入待檢測(cè)化合物與體系的總體積為25μL。37℃條件下孵育30 min后于每個(gè)孔中加入1×Fluor de Lys developer solution（含有2 mmol·L-1煙酰胺）25μL終止反應(yīng)，反應(yīng)在半?yún)^(qū)96孔板中進(jìn)行。多功能酶標(biāo)儀360 nm激發(fā)光，460 nm發(fā)射光條件下測(cè)取各孔熒光值。

2.3 SIRT6體外活性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)利用CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit檢測(cè)化合物對(duì)SIRT6體外活性的影響。檢測(cè)體系中含2.5μL帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的底物多肽（0.1mmol·L-1），2.5μL NAD（8mmol·L-1），2.5μL Developer，2.5μL重組 SIRT6（空白組除外）以及2.5μL SIRT6實(shí)驗(yàn)緩沖液。實(shí)驗(yàn)組加入待檢測(cè)化合物，使化合物終濃度為200μmol·L-1，反應(yīng)體系總體積為25μL。空白與對(duì)照組加入等量的溶解化合物的溶劑，實(shí)驗(yàn)在半?yún)^(qū)96孔板中進(jìn)行。多功能酶標(biāo)儀于37℃、490 nm激發(fā)光，530 nm發(fā)射光條件下測(cè)取各孔熒光值。

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色固體，ESI-MS：m／z299［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.81（1H，s，H-7′），7.55（1H，brs，H-2′），7.42（1H，brs，H-6′），6.97（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），5.69（1H，d，J＝6.5 Hz，H-7），3.89（2H，d，J＝5.9 Hz，H-9），3.96（3H，s，5′-OCH3），3.85（3H，s，3-OCH3），3.64（1H，m，H-8）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)基本一致［10］，故確定化合物1為榕醛。

化合物2：淡黃色固體，ESI-MS：m／z345［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.23（1H，d，J＝1.9 Hz，H-3），6.01（1H，d，J＝1.9 Hz，H-5），4.90（1H，overlap，H-1′），3.90（1H，dd，J＝12.2，1.5 Hz，Ha-6′），3.87（3H，s，7-OCH3），3.71（1H，dd，J＝12.2，4.8 Hz，Hb-6′），3.30～3.52（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：98.7（C-1），164.8（C-2），96.6（C-3），165.0（C-4），98.3（C-5），161.2（C-6），172.0（C-7），102.5（C-1′），74.9（C-2′），78.0（C-3′），71.2（C-4′），78.4（C-5′），62.4（C-6′），52.6（7-OMe）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)基本一致［11］，故確定化合物2為4，6-二羥基苯甲酸甲酯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：淡黃色固體，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.78（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），6.94（1H，s，H-5），6.75（1H，s，H-8），6.18（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：164.3（C-2），112.8（C-3），146.1（C-4），112.5（C-4a），113.0（C-5），144.6（C-6），152.1（C-7），103.6（C-8），150.5（C-8a）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［12］，故確定化合物3為馬栗樹皮素。

化合物4：淡黃色固體，ESI-MS：m／z325［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.73（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.48（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2，H-6），6.81（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3，H-5），6.37（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），5.57（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），3.85（1H，dd，J＝12.2，1.9 Hz，Ha-6′），3.69（1H，dd，J＝12.2，4.6 Hz，Hb-6′），3.30～3.48（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［13］，故確定化合物4為對(duì)羥基肉桂酸葡萄糖酯。

化合物5：淡黃色固體，ESI-MS：m／z193［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.59（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），7.06（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.31（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），3.89（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.5（s，C-9），149.3（s，C-3），147.8（s，C-4），145.2（d，C-7），126.3（C-1），123.4（C-6），115.2（C-5），114.7（C-8），110.0（C-2），55.6（3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［14］，故確定化合物5為反式阿魏酸。

化合物6：淡黃色固體，ESI-MS：m／z179［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.53（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.04（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.93（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.22（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［15］，故確定化合物6為反式咖啡酸。

化合物7：淡黃色固體，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7），7.47（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.82（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），6.34（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8），3.77（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.2（C-9），160.3（C-4），145.4（C-7），131.2（C-2，C-6），128.5（C-1），117.1（C-8），114.9（C-3，C-5），56.3（4-OCH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［16］，故確定化合物7為對(duì)甲氧基桂皮酸。

化合物8：淡黃色固體，ESI-MS：m／z163［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.55（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.90（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），7.62（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），6.34（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.3（C-3，C-5），157.8（C-4），145.2（C-7），114.7（C-8），167.5（C-9）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［14］，故確定化合物8為對(duì)羥基桂皮酸。

化合物9：淡黃色固體，ESI-MS：m／z209［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.77（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.69（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.62（1H，dd，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），3.84（3H，s，3-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.59（2H，t，J＝7.6 Hz，H-8），2.87（2H，t，J＝7.6 Hz，H-7）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)基本一致［17］，故確定化合物9為二氫阿魏酸甲酯。

化合物10：淡黃色固體，ESI-MS m／z：167［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.44（1H，dd，J＝7.5，1.6 Hz，H-6），6.74（1H，d，J＝7.5 Hz，H-5），7.54（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），3.85（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：122.2（C-1），113.7（C-2），149.4（C-3），147.6（C-4），114.8（C-5），123.9（C-6），171.2（C-7），56.1（3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［18］，故確定化合物10為香草酸。

化合物11：淡黃色固體，ESI-MS：m／z 153［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.45（1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），7.43（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：121.7（C-1），122.5（C-2），144.7（C-3），150.1（C-4），114.3（C-5），116.3（C-6），168.8（C-7）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［19］，故確定化合物11為原兒茶酸。

化合物12：白色固體，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.83（1H，d，J＝7.4 Hz，H-2，H-6），6.76（1H，d，J＝7.4 Hz，H-3，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：128.0（C-1），132.4（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），161.3（C-4），171.2（C-7）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［20］，故確定化合物12為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物13：淡黃色固體，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.69（1H，s，H-7），7.30（1H，dd，J＝1.9 Hz，H-2），7.28（1H，d，J＝7.8，1.9 Hz，H-6），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［21］，故確定化合物13為原兒茶醛。

化合物14：白色固體，ESI-MS m／z：129［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.81（1H，d，J＝15.9 Hz，H-3），6.76（1H，d，J＝15.9 Hz，H-2），3.79（3H，s，1-OCH3）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［22］，故確定化合物14為（E）-2-丁烯二酸單甲酯。

3.2 活性測(cè)試

對(duì)抗衰老的自然過程一直是人類科學(xué)研究的焦點(diǎn)，黑果枸杞主要用于抗氧化和抗衰老，對(duì)其的開發(fā)和利用引起了人們廣泛關(guān)注和重視。近年來發(fā)現(xiàn)長壽基因SIRT1去乙?；冈谘泳徤矬w衰老過程中扮演著十分重要的角色，SIRT6通過干預(yù)基因組的穩(wěn)定性而影響衰老進(jìn)程，由于化合物3～13的結(jié)構(gòu)為常見酚性化合物，因此，我們僅對(duì)分離得到的化合物1和2進(jìn)行了SIRT1和SIRT6體外活性測(cè)試，遺憾的是，這兩個(gè)化合物并未顯示活性。鑒于黑果構(gòu)杞本身對(duì)抗衰老的作用，因此可以預(yù)見其中的其他化合物可能是其抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論與討論

黑果枸杞的開發(fā)利用近年逐漸升溫，其甚至被譽(yù)為 “軟黃金”美譽(yù)，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究還很薄弱，我們本次報(bào)道分離得到的14個(gè)酚性化合物，其中化合物1～4、7、9和14為首次從黑果枸杞中分離得到，此外對(duì)化合物1和2也進(jìn)行了抗衰老相關(guān)的SIRT1和SIRT6體外活性測(cè)試，雖然未顯示出相關(guān)活性，可以預(yù)見其中的其他化合物可能是其抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步挖掘。

［1］ 任小娜，曾俊，王玉濤.黑果枸杞的植物化學(xué)成分及生物活性研究現(xiàn)狀［J］.食品工業(yè)，2014，35（11）：231-234.

［2］ 夏園園，莫仁楠，曲瑋，等.黑果枸杞化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2015，39（5）：351-356.

［3］ Duan Y B，Chen F，Yao X C，et al.Protective effect of Lycium ruthenicum Murr.against radiation injury in mice［J］.Int JEnviron Res Public Health，2015，12（7）：8332-8347.

［4］ 丁玉靜，劉俊秀，李金紅，等.黑果枸杞生理活性成分及作用研究進(jìn)展［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2017，33（13）：1280-1283.

［5］ Wang H Q，Li JN，Tao WW，et al.Lycium ruthenicum studies：Molecular biology，phytochemistry and pharmacology［J］.Food Chem，2018，240（1）：759-766.

［6］ 歐陽發(fā)，吉騰飛，蘇亞倫，等.黑果枸杞果實(shí)化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2012，35（10）：1599-1601.

［7］ 張佳，赫軍，張蕾，等.黑果枸杞果實(shí)化學(xué)成分研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2016，51（24）：2150-2154.

［8］ Zhao J，Xu F，Ji T F，et al.A new spermidine from the fruits of Lycium ruthenicum［J］.Chem Nat Compd，2014，50（5）：880-883.

［9］ 許志誠.黑果枸杞特色產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀與前景展望［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（12）：244.

［10］Chung H P，Hsu C Y，Lin JH，et al.Antiproliferative lactams and spiroenone from adlay bran in human breast cancer cell lines［J］.JAgric Food Chem，2011，59（4）：1185-1194.

［11］黃鐘輝，郝倩，李蓉濤，等.菝葜的化學(xué)成分研究［J］.昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，39（1）：80-86.

［12］趙曉宏，陳迪華，斯建勇，等.中藥升麻酚酸類化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（7）：535-538.

［13］郭志琴，郭強(qiáng)，朱枝祥，等.藏藥多刺綠絨蒿的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2014，39（7）：1152-1156.

［14］Wang W，Guo J，Zhang J N，et al.Isolation，identification and antioxidant activity of bound phenolic compounds present in rice bran［J］.Food Chem，2015，171：40-49.

［15］費(fèi)永和，陳重，李笑然，等.向日葵種子的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2014，45（5）：631-634.

［16］王章偉，徐向紅，陳笑天，等.窄葉鮮卑花地上部分化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2014，37（1）：57-60.

［17］Beck JJ，Kim JH，Campbell B C，et al.Fungicidal activities of dihydroferulic acid alkyl ester analogues［J］.JNat Prod，2007，70（5）：778-782.

［18］劉普，鄧瑞雪，段宏泉，等.糙蘇根的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（7）：867-870.

［19］舒永志，成亮，曹濬喆，等.黑老虎的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2012，43（3）：428-431.

［20］王立業(yè)，王乃利，姚新生.龍葵中的非皂苷類成分［J］.中藥材，2007，30（7）：792-794.

［21］Kang H S，Chio JH，Cho W K，et al.A sphingolipid and tyrosinase inhibitor from the fruiting body of Phellinus linteus［J］.Arch Pharm Res，2004，27（7）：742-750.

［22］ Davis R A.Isolation and structure elucidation of the new fungalmetabolite（-）-xylariamide A［J］.JNat Prod，2005，68（5）：769-772.