壽艷紅 楊永生 徐金華

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes，KC）構(gòu)成了抵御微生物侵襲的第一道防線，它具有嚴(yán)格的增殖與分化過(guò)程，構(gòu)成了表皮的各個(gè)層次。細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)、有序、由基因控制的細(xì)胞死亡方式，適度的細(xì)胞凋亡在皮膚穩(wěn)態(tài)中起重要作用。與凋亡不同，壞死被認(rèn)為是不可控制的細(xì)胞死亡。隨著對(duì)細(xì)胞死亡機(jī)制的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)在某些情況下，壞死也是受一系列信號(hào)分子調(diào)控的、有序的過(guò)程。Degterev等［1］發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)Nec?1，能特異性阻斷由死亡受體信號(hào)通路引發(fā)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）非依賴性細(xì)胞死亡，但不影響凋亡的發(fā)生，這種能被Nec?1特異性抑制的細(xì)胞壞死方式被命名為程序性壞死（necroptosis）。

一、程序性壞死的調(diào)控機(jī)制

1.程序性壞死主要的啟動(dòng)因子：程序性壞死可由多種觸發(fā)因子誘發(fā)，包括腫瘤壞死因子α（TNF?α）、死亡受體（Fas）、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體、干擾素γ（IFN?γ）、脂多糖、DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、病毒感染等。TNF?α是一種多功能細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞的作用復(fù)雜，并且在大多數(shù)情況下導(dǎo)致核因子κB（NF?κB）途徑激活。但根據(jù)細(xì)胞種類和內(nèi)環(huán)境不同，TNF?α也可通過(guò)與其受體結(jié)合，使TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TNF?receptor associated death domain，TRADD）向受體相互作用蛋白激酶 1（receptor interaction protein kinase 1，RIP1）發(fā)出信號(hào)，募集受體相互作用蛋白激酶3（receptor interaction protein kinase 3，RIP3）形成壞死體后，通過(guò)激活混合系激酶區(qū)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain?like protein，MLKL）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等下游因子執(zhí)行程序性壞死［2］。

2.RIP1在程序性壞死中的作用：RIP1是Fas、TNF?α等誘導(dǎo)程序性壞死所需的第一個(gè)蛋白質(zhì)，具有3種結(jié)構(gòu)域：N末端是絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶結(jié)構(gòu)域，用于磷酸化并調(diào)節(jié)底物；C末端為死亡結(jié)構(gòu)域，募集Fas相關(guān)死亡域蛋白（Fas?associated with death domain protein，F(xiàn)ADD）和caspase?8；N末端和C末端之間是一段中間結(jié)構(gòu)域，其靠近C末端處為同型作用結(jié)構(gòu)域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），介導(dǎo)同源作用，可與其他含RHIM的分子互相作用［3］。在TNF?α刺激下，RIP1結(jié)構(gòu)域各自發(fā)揮不同的作用，參與形成復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅱ和壞死體，執(zhí)行不同的功能。RIP1與TRADD通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，募集TNF受體相關(guān)因子、凋亡抑制因子等構(gòu)成復(fù)合物Ⅰ，該復(fù)合物通過(guò)募集NF?κB組成IκB激酶復(fù)合物調(diào)節(jié)劑等，導(dǎo)致NF?κB途徑激活，促進(jìn)炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)。TRADD從復(fù)合物Ⅰ上解離后，募集FADD和caspase?8形成復(fù)合物Ⅱ，引起細(xì)胞凋亡［4］。當(dāng)復(fù)合物Ⅱ中的caspase?8失活時(shí)，具有激酶活性的RIP1募集RIP3，并通過(guò)各自的RHIM相互作用，形成壞死體，引發(fā)程序性壞死［5］。

3.程序性壞死特異性蛋白R(shí)IP3：RIP3是RIP1的同源激酶，具有相似的N端激酶結(jié)構(gòu)域，過(guò)表達(dá)時(shí)可以促成NF?κB活化的中間結(jié)構(gòu)域；其C末端還含有RHIM結(jié)構(gòu)域，但與RIP1相比缺乏C端死亡域。在敲入突變的Ripk3D161N/D161N基因小鼠中，RIP3激酶失活，程序性壞死被抑制，提示RIP3激酶是誘導(dǎo)程序性壞死所必需的［6］。RIP3在賴氨酸處K63泛素化可促進(jìn)RIP1和RIP3通過(guò)RHIM結(jié)合［7］，導(dǎo)致RIP3磷酸化，從而募集下游蛋白MLKL［8］；而小鼠巨細(xì)胞病毒可以激活另一個(gè)含RHIM結(jié)構(gòu)域的干擾素調(diào)節(jié)因子的DNA依賴性激活因子，與RIP3的同型RHIM相互作用，引起RIP3依賴性程序性壞死，該過(guò)程中并無(wú)RIP1參與［9］。因此，相較于RIP1，RIP3在程序性壞死中更具有特異性。

4.程序性壞死的執(zhí)行者：研究發(fā)現(xiàn)，MLKL敲除小鼠與RIP3敲除小鼠具有相似的抵抗程序性壞死的能力［10］，提示MLKL參與程序性壞死的進(jìn)程。磷酸化MLKL信號(hào)可以被Nec?1（RIP1激酶活性抑制劑）阻斷，但不能被NSA（MLKL功能抑制劑）阻斷，且RIP1信號(hào)表達(dá)不受NSA影響，說(shuō)明MLKL的作用位于RIP1/RIP3的下游［11］。因此推測(cè)，MLKL是程序性壞死的執(zhí)行者。MLKL是一種有激酶結(jié)構(gòu)域、但無(wú)激酶活性的假激酶［12］，通過(guò)其C末端假激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合RIP3后被磷酸化［11?13］。Wang等［11］分析不同時(shí)間段細(xì)胞提取物，磷酸化的MLKL開始存在于細(xì)胞質(zhì)中，后逐漸在膜上出現(xiàn)，提示MLKL磷酸化后從細(xì)胞溶膠轉(zhuǎn)移至膜上，對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行滲透、破壞后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

MLKL下游調(diào)控機(jī)制仍不明確，除MLKL破壞細(xì)胞膜完整性的假設(shè)外，也有研究認(rèn)為ROS執(zhí)行細(xì)胞死亡［14］。小鼠成纖維細(xì)胞L929中，在TNF?α刺激下，RIP3能夠激活關(guān)鍵代謝酶，導(dǎo)致能量代謝增加，隨后產(chǎn)生大量ROS，包括O2?、H2O2等［14］。ROS在MLKL活化的上游和下游都起作用，一方面，ROS促進(jìn)RIP1/RIP3壞死體穩(wěn)定，啟動(dòng)正反饋擴(kuò)增循環(huán)［15］；另一方面，過(guò)度產(chǎn)生的ROS可以損傷脂類、蛋白、DNA等，影響Ca2+濃度，引起細(xì)胞壞死。另外，活性氮、神經(jīng)酰胺等也可能執(zhí)行程序性壞死［16］。

二、KC及相關(guān)疾病與程序性壞死

HaCaT細(xì)胞（永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株）和原代KC中，胰蛋白酶抑制劑對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡影響很小，而Nec?1可以顯著降低細(xì)胞死亡，胰蛋白酶抑制劑與Nec?1的組合對(duì)細(xì)胞死亡具有更顯著抑制作用［17］。RIP3激酶活性抑制劑或MLKL功能抑制劑都可以保護(hù)原代KC免受硝普鈉誘導(dǎo)的死亡［18］。在HaCaT細(xì)胞、原代KC中，敲低RIP1或RIP3都可抑制硝普鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而RIP3缺陷型動(dòng)物中RIP1正常表達(dá)，未能檢測(cè)到磷酸化MLKL［19?20］，說(shuō)明在KC程序性壞死中RIP3位于RIP1下游，MLKL位于RIP3下游。

目前發(fā)現(xiàn)，程序性壞死參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，在炎癥性皮膚病中具有重要作用。炎癥性皮膚病是一組復(fù)雜的、免疫介導(dǎo)的非傳染性皮膚疾?。?1］。Bonnet等［20］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD特異性敲除的小鼠發(fā)生RIP3依賴性程序性壞死和炎癥性皮膚損傷，caspase?8特異性敲除小鼠也發(fā)展為炎癥性皮膚損傷，而在這些小鼠中進(jìn)一步敲除RIP3可以預(yù)防皮損［22］，說(shuō)明KC程序性壞死在炎癥性皮膚病中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性皮膚病如扁平苔蘚、紅斑狼瘡等中可檢測(cè)到界面皮炎，其基本特征為免疫細(xì)胞浸潤(rùn)表皮基底膜且細(xì)胞膨脹、KC大量凋亡［23］。Lauffer等［24］發(fā)現(xiàn)，用扁平苔蘚和紅斑狼瘡皮損部位T細(xì)胞上清液（T?cell supernatant，TCS）刺激KC，RIP3和磷酸化MLKL表達(dá)皆上調(diào)；用除去了IFN?γ和TNF?α的TCS刺激KC，未檢測(cè)到RIP3和磷酸化MLKL活化；用僅除去IFN?γ的TCS和僅除去TNF?α的TCS分別刺激KC，均可見RIP3和磷酸化MLKL表達(dá)增加。由此可見界面皮炎發(fā)病機(jī)制中，除細(xì)胞凋亡之外，KC程序性壞死也發(fā)揮著重要作用，可能通過(guò)IFN?γ和TNF?α激活RIP3、磷酸化MLKL等，引起KC死亡，但仍需進(jìn)一步研究。

中毒性表皮壞死松解癥（TEN）以KC廣泛性壞死為特征。目前認(rèn)為，藥物在特殊的遺傳背景下激活T細(xì)胞克隆增殖，遷移至皮膚，通過(guò)直接的細(xì)胞毒作用或釋放凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子放大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致KC大量死亡［25］，死亡過(guò)程包括細(xì)胞凋亡和壞死。Saito等［26］首次用電鏡發(fā)現(xiàn)，在TEN中KC發(fā)生的壞死是程序性壞死，小鼠實(shí)驗(yàn)中通過(guò)抑制程序性壞死可以完全阻斷TEN樣病變。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)，TEN患者皮膚切片中RIP3高表達(dá)，磷酸化MLKL升高，提示可能通過(guò)RIP3表達(dá)上調(diào)，與RIP1結(jié)合后，產(chǎn)生ROS，激活MLKL等下游因子，引起KC程序性壞死［27］，而RIP3高表達(dá)可以引起KC對(duì)壞死刺激高敏、ROS產(chǎn)生、c?Jun氨基末端激酶（JNK）通路激活，從而加重病理過(guò)程［25］。

凋亡相關(guān)蛋白在皮膚穩(wěn)態(tài)中有重要作用，可與caspase?8聚合形成異源二聚體，此時(shí)caspase?8不能啟動(dòng)凋亡，而是通過(guò)對(duì)RIP1 Asp324位點(diǎn)和RIP3 Asp328位點(diǎn)的切割［7］，防止RIP1/RIP3復(fù)合物形成來(lái)抑制程序性壞死［19］。在TEN/Stevens?Johnson綜合征（SJS）患者的皮損中，凋亡相關(guān)蛋白的表皮表達(dá)顯著降低，而在健康皮膚基底層高表達(dá)，由此推測(cè)凋亡相關(guān)蛋白缺失可能是TEN/SJS患者細(xì)胞大量死亡的先決條件［26，28］。由此引起的皮膚炎癥可以通過(guò)中和TNF來(lái)緩解，目前TNF?α拮抗劑如英夫利西單抗已被用于TEN的治療，在一些病例中顯示較好療效［27，29］。最新臨床試驗(yàn)也表明，TNF?α拮抗劑依那西普改善了SJS?TEN患者的預(yù)后［30］。

三、展望

KC的程序性壞死已在TEN中被發(fā)現(xiàn)，提示曾經(jīng)被認(rèn)為是無(wú)法控制的細(xì)胞壞死有可能被調(diào)控。雖還未明確程序性壞死是否為TEN的罪魁禍?zhǔn)谆蚶^發(fā)于TEN的病理生理表現(xiàn)，RIP1激酶活性的抑制通常會(huì)減緩或阻止疾病進(jìn)展，因此也可考慮將其應(yīng)用于阻斷KC大量壞死，減輕疾病嚴(yán)重程度［31］。此外，在小鼠模型中已發(fā)現(xiàn)，KC的程序性壞死對(duì)表皮的自穩(wěn)有重要作用，界面皮炎發(fā)病機(jī)制的研究已證實(shí)KC程序性壞死的作用，因此在炎癥性皮膚病如特應(yīng)性皮炎、銀屑病中，KC的程序性壞死可能是又一研究靶點(diǎn)。