楊一鳴，姜 萌，鄢雨晴，何天琦，董 浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118)

細小病毒是一類目前發(fā)現(xiàn)存在于自然界中形態(tài)最小的動物病毒，該病毒表面無囊膜，由正二十面體的衣殼包裹[1]。該病毒現(xiàn)已呈世界性感染，自然感染宿主范圍廣泛。目前感染較為廣泛的幾種細小病毒包括豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)、貓細小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)和鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)。

豬細小病毒是由Mary和Mahnel在1966年首次發(fā)現(xiàn)，主要感染動物是豬，可引起母豬發(fā)生繁殖障礙病，其在豬群中檢出率甚高，是目前導致胚胎和胎兒死亡的主要病毒。當前研究發(fā)現(xiàn)，感染PPV后可導致仔豬腹瀉、發(fā)生皮炎及呼吸系統(tǒng)疾病，同時與多種疾病有關，如仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬非化膿性心肌炎和豬消瘦綜合癥。PPV在豬群中的血清抗體陽性率高達50%～80%，因此給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]，嚴重影響和制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

犬細小病毒最早是在1977年由美國學者Eugster和Nairnl發(fā)現(xiàn)，該病毒自發(fā)現(xiàn)以來就一直在世界范圍內(nèi)傳播。研究發(fā)現(xiàn)，CPV從抗原性角度與FPV關系密切，當前研究表明因突變而產(chǎn)生。在體外環(huán)境下，F(xiàn)PV只可感染組織培養(yǎng)的貓細胞，而CPV-2可致使組織培養(yǎng)的犬細胞和貓細胞感染，但無法感染貓。CPV與FPV在DNA序列上同源性高達99%，因此，學者們普遍認為，CPV是由FPV發(fā)生基因突變而產(chǎn)生的。CPV對于不同年齡及品種的犬都易感，且死亡率高達20%～100%[3]，給當前養(yǎng)犬業(yè)帶來巨大的危害[4]。

貓細小病毒在1928年被Verge等學者首次發(fā)現(xiàn)，后分別在1957年、1964年被Bilin、Johnson分離出來，目前已在世界各地廣泛分布和傳播。FPV是一種典型的肉食獸細小病毒，其感染范圍大，包括貓及其他貓科成員、熊科動物(如浣熊、大熊貓等)、臭鼬、水貂、狐貍等[5-6]。FPV對感染動物并無年齡限制，但幼貓易感性最強，感染該病的幼貓死亡率可高達90%以上，且該病的傳染性極強，經(jīng)常使整窩幼貓同時發(fā)病或陸續(xù)發(fā)病。

鵝細小病毒在1956年被我國學者方定一首次發(fā)現(xiàn)，由匈牙利學者Derzsy在1966年首次公開并在1971年確定小鵝瘟病原為GPV[7]，在1995年Zadori等學者獲得其全基因組序列。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒可在雛鵝及雛番鴨群中引起小鵝瘟病，但對其他禽類及哺乳動物尚未發(fā)現(xiàn)感染性。其致病性及死亡率極高，是養(yǎng)鵝業(yè)中極為重視的疾病之一[8]。由于該病所造成的經(jīng)濟損失較為嚴重，所以自發(fā)現(xiàn)以來對小鵝瘟的研究和防控做了大量的研究工作。

作為當前研究的熱點，動物細小病毒致病機制研究成果較少，為了更好地了解動物細小病毒及其致病機制，對4種動物細小病毒致病機制研究成果進行整理，為動物細小病毒研究提供一些借鑒。

1 4種細小病毒病原學

細小病毒不具有囊膜，含有球形20面體對稱衣殼，為單股DNA病毒。病毒粒子呈六角形或圓形[9]。

1.1 豬細小病毒

PPV直徑為20～28 nm，核衣殼由32個殼粒組成?？赡?、猴、貓、雞、小鼠、豚鼠等動物的紅細胞。相對于一般的病毒，PPV對高溫和酸堿性環(huán)境的抵抗力較強。在56 ℃環(huán)境下加熱48 h，病毒傳染性、凝集紅細胞能力均無明顯變化。在70 ℃條件下加熱2 h，病毒仍存在感染力但有所下降。在80 ℃條件下加熱5 min后觀察發(fā)現(xiàn)，PPV失去活性。在甲醛蒸汽情況下需較長時間才可滅活，在20% NaOH溶液中需至少5 min，或在0.5%漂白粉及2% NaOH溶液中5 min，或在3%甲醛溶液中1 h可滅活[10]。

1.2 犬細小病毒

CPV直徑為20 nm，其抗原性與貓細小病毒及水貂腸炎病毒關系密切。在4 ℃條件下可使豬、恒河猴的紅細胞發(fā)生凝集。CPV具有很強的抵抗力，對于大多數(shù)的理化因素及試劑抗性都較強。在4～10 ℃環(huán)境下可存活6個月，在37 ℃環(huán)境下可存活2周左右，在56 ℃下可存活24 h，80 ℃條件下可存活15 min。CPV在糞便中可存活數(shù)月甚至數(shù)年之久。CPV對于乙醚、氯仿有機溶劑及醇類試劑有著一定的抵抗力，但對于紫外線、福爾馬林、甲醛、次氯酸鈉、氧化劑較為敏感。

1.3 貓細小病毒

FPV直徑為20～24 nm。FPV在4 ℃、pH值為6.5～6.8環(huán)境中對豬紅細胞凝集，pH值過低時會出現(xiàn)紅細胞自凝現(xiàn)象，該情況下需加入0.05%的牛血白蛋白或0.5%滅活的兔血清作為穩(wěn)定劑。FPV具有較強抵抗力，在65 ℃環(huán)境中加熱30 min不會完全失去活力。對于酸、堿、酚、乙醚、胰蛋白、氯仿及丙酮等脂溶性溶劑均有抵抗力。使用0.5%的福爾馬林和0.175%的次氯酸鈉可有效地滅活病毒。

1.4 鵝細小病毒

GPV直徑為20～25 nm。根據(jù)國外學者報道，GPV可使黃牛的精子凝集。不能凝集雞、鴨、鵝、羊、兔、豚鼠和小鼠的紅細胞[11]。GPV在不良環(huán)境下的抵抗力較強，在37 ℃、pH值3.0環(huán)境下作用1 h，仍能保持其感染性。在56 ℃環(huán)境中3 h，仍具有活性[12]。GPV對乙醚和脂溶性試劑不敏感。

2 4種細小病毒分子生物學特征

細小病毒的基因組中主要的開放閱讀框架有2個，分別為3′端編碼的結構蛋白VP與5′端編碼的非結構蛋白NS。

2.1 豬細小病毒

PPV基因組長度約為5 000 bp，基因組兩端均有發(fā)夾結構。PPV兩端均為回文結構，5′端長度為127 bp，形成U形結構，3′端長度為102 bp，形成Y形結構。Molitor等[12]研究表明，PPV無論毒株強弱在VP2基因759—917位點處均有連續(xù)的158個堿基，該段基因序列為PPV所特有。VP2是PPV主要的衣殼蛋白，通過研究表明，缺失VP2蛋白的突變體會導致病毒喪失對宿主細胞的再感染能力[13]。通過研究分析，NS1作為PPV的反式激活蛋白，在病毒的復制和轉(zhuǎn)錄中起到至關重要的作用，特別是NS1的磷酸化及糖基化功能。

2.2 犬細小病毒

CPV基因組中含有2個轉(zhuǎn)錄啟動子，分別為P4和P38啟動子，P4啟動子主要負責轉(zhuǎn)錄非結構蛋白NS1及NS2，P38啟動子主要負責轉(zhuǎn)錄結構蛋白VP1及VP2。CPV的VP1基因大小約為2 256 bp， 當中也包含VP2基因的完整閱讀框架。在CPV中VP1與VP2結構極為相似，區(qū)別在于VP1的N端較VP2多出特有的143個氨基酸殘基序列，其中VP2基因全長1 755 bp，編碼584 個氨基酸[14]。而作為自主性細小病毒特有的VP3僅在完整的病毒粒子衣殼蛋白中存在。在CPV、FPV研究中發(fā)現(xiàn)，Poly(A)序列下游具有TATA序列，TATA序列是RNA多聚酶起始轉(zhuǎn)錄識別部位，位于5′端帽子部位上游序列30—35 bp處。前人研究表明，細小病毒中VP2蛋白的表面具有“抗受體”，能夠與細胞上的受體結合并啟動內(nèi)化過程[15]。由此證明，VP2蛋白在病毒增殖過程中，決定病毒的宿主范圍，對結合及進入細胞等都起到重要作用。

2.3 貓細小病毒

FPV基因組長約5 200 bp。FPV同樣具有回文結構，其中3′端的結構長度固定，但5′端的結構長短不一，可含有1～3個重復序列，這2個回文結構與FPV基因組的復制密切相關，能夠使宿主細胞的RNA聚合酶Ⅱ分別啟動結構蛋白(VP1和VP2)和非結構蛋白(NS1和NS2)轉(zhuǎn)錄。有學者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PV或CPV的基因組具有互補性，即在病毒粒子中部分DNA分子有正極性，同時還有部分DNA分子有負極性。而在近期研究中表明，只有負極性的DNA鏈才可以被包裝進入病毒粒子中。

2.4 鵝細小病毒

GPV基因組長度約為5 106 bp。其中包括2個開放閱讀框，兩者間隔18個堿基，同時兩端含有末端倒置重復序列(ITR)：左側的ORF編碼非結構蛋白(NS1和NS2)，產(chǎn)生于病毒復制的早期，也稱Rep蛋白；右側的ORF編碼結構蛋白(VP1、VP2、VP3)，編碼核酸數(shù)分別為2 199 nt、1 764 nt和1 605 nt。VP1和VP3的起始密碼子是較為常見的AUG，而VP2則是以不典型的ACG為起始密碼子。目前發(fā)現(xiàn)的所有GPV毒株的VP2起始密碼子均為ACG，具有高度的保守性。VP1對病毒感染有著重要作用，可幫助病毒或DNA順利進入細胞核內(nèi)部，或與宿主細胞的特殊受體結合，使病毒進行有效的感染。VP2是主要免疫功能區(qū)，具有免疫原性，可通過刺激機體使其產(chǎn)生抗體。有研究對GPV氨基酸序列進行配對分析，發(fā)現(xiàn)VP3中含有GPV主要抗原決定簇成分，由此推斷，VP3是決定病毒毒力的基因[16]。

3 4種細小病毒致病機制

3.1 豬細小病毒

Oraveerakul等[17]為了解2株PPV毒株致病性不同的原因，利用原位雜交技術來檢測兩毒株在豬胎兒體內(nèi)復制部位及數(shù)量上的差異，結果表明，對于不同毒株，其DNA的復制具有組織選擇性，不同組織中病毒含量有所不同。Bergeron等[18]研究認為，PPV的非結構蛋白及結構蛋白決定著該病毒的宿主范圍。李厚偉等[19]研究檢測確定PPV感染定植部位為母豬的子宮，由此推斷，PPV對宿主的致病部位主要是在繁殖器官，通過觀察發(fā)現(xiàn)，就仔豬而言，病毒主要集中在其腎臟、脾臟和腸道淋巴結部位。姜永厚等[20]利用ELISA雙抗體夾心法檢測感染豬不同臟器中的病毒分布情況，檢出結果分別為：肝臟中含量為22.7%，心臟中含量為36.4%，脾臟中含量為50%，腎臟中含量為66.7%。PPV在感染妊娠母豬后，可使其黃體發(fā)生萎縮，導致失去抑制排卵及分泌孕酮的能力。前人研究證明，PPV誘導宿主炎癥反應[21]。當前PK-15細胞是一種已知的豬腎上皮細胞系，被證明是研究PPV激活的NF-κB信號通路的合適細胞系，當PPV感染PK-15后，NF-κB基因活性提高，Jak1基因表達量增加，據(jù)此推測PK-15細胞可通過激活NF-κB依賴性途徑和JAK/STAT途徑來抵抗PPV感染[22]。

3.2 犬細小病毒

Raj等[23]研究表明，CPV導致犬急性出血性腸胃炎，并且主要由于VP2基因的突變而易于遺傳進化。CPV主要的自然感染方式為口腔感染，因此病毒的定植部位大多數(shù)為口腔咽鼻(包括扁桃腺及其他淋巴組織)。經(jīng)過血液傳播病毒對其他器官進行感染，一般情況下感染后的1～3 d可在扁桃體、咽淋巴結、胸腺、胸淋巴結中檢測到CPV，在感染的3 d后，腸腔的相關淋巴結組織內(nèi)均可檢測到CPV。Hoelzer等[24]發(fā)現(xiàn)，CPV的復制發(fā)生在迅速分裂的小腸的絨毛上皮細胞中，CPV在宿主中主要攻擊2種細胞，分別為腸上皮細胞和心肌細胞。感染腸腺胚上皮組織后，導致細胞無法正常代謝更新，從而引起上皮組織被破壞，腸絨毛變短，腸腺上皮細胞發(fā)生不同程度的壞死、脫落。當CPV感染心肌細胞時，病毒在心肌細胞內(nèi)進行大量增殖，心肌毛細血管發(fā)生擴張及充血現(xiàn)象，同時淋巴和骨髓增殖細胞受到嚴重損傷，導致淋巴細胞減少。因此，當CPV感染嚴重時會伴隨出現(xiàn)淋巴細胞減少癥和中性粒細胞減少癥。Nho等[25]利用原位雜交法對石蠟組織切片中的CPV進行檢測，結果表明，在同一幼犬體內(nèi)肝臟、腎臟及心臟組織中均存在CPV，說明CPV侵害器官組織種類范圍逐漸擴大。

3.3 貓細小病毒

FPV通常最初是在宿主的口咽部定植復制，隨后將會發(fā)生病毒血癥2～7 d，在其過程中病毒分布在全身的各個組織中。由于細小病毒的特性，F(xiàn)PV主要侵害快速分化或分裂的組織，例如幼獸的腸上皮細胞及骨髓或是妊娠母獸的胎盤及胎兒等。FPV在感染6周齡以上貓中，淋巴組織、骨髓及腸黏膜最常受到影響。在感染淋巴組織時，F(xiàn)PV可使細胞衰竭從而引起免疫抑制。在病毒作用過程中淋巴細胞不僅出現(xiàn)直接溶解現(xiàn)象，同時淋巴細胞也會遷移到組織中。FPV會阻礙腸內(nèi)隱窩中的細胞黏膜的快速復制但對不分開的吸收細胞尖端絨毛不產(chǎn)生影響。由于隱窩細胞受到破壞致使腸絨毛損傷，使患病動物吸收不良而產(chǎn)生腹瀉。

3.4 鵝細小病毒

當前GPV的致病機制研究仍不十分清楚，且相關研究報道較少。關于宿主細胞的種類區(qū)別、細胞受體的類型劃分及跨膜侵染機制等研究均未見報道，近年來GPV致病機制研究越來越受到人們的重視，特別是GPV在患病雛鵝體內(nèi)的定植部位、病毒復制機制等。通過資料了解GPV在宿主體內(nèi)各組織的分布情況，GPV最終定植部位可能為腸道上皮細胞。通過PCR方式檢測病鵝體內(nèi)病毒含量情況，發(fā)現(xiàn)在感染后24 h內(nèi)即可在心臟、肝臟、肺部、腎臟、脾臟、十二指腸、空腸、胸腺等部位檢測到GPV，在感染的第3天在盲腸內(nèi)檢測到GPV，在感染的第4天在糞便及大腦中檢測GPV呈陽性，在感染的第5天在食道中檢測到GPV。而在感染后的第6天開始發(fā)現(xiàn)，GPV在各組織中含量逐漸降低甚至消失，首先檢測GPV呈陰性的部位為肝臟，后在盲腸及血液中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)GPV檢測為陰性的情況。感染GPV后，病毒侵染空腸盲腸使其發(fā)生急性亞急性卡他性-纖維素性壞死性炎癥，逐漸出現(xiàn)固有膜結構發(fā)生紊亂，單核細胞和淋巴細胞發(fā)生彌漫性浸潤，大多數(shù)腸腺結構被破壞，上皮細胞壞死脫落，腦膜充血，神經(jīng)細胞變性等病變。根據(jù)多位學者的研究分析推測，GPV的Rep蛋白對于GPV的病毒增殖、病毒對宿主細胞的作用及其毒性影響都有著重要作用。對GPV結構基因序列比較，發(fā)現(xiàn)結構蛋白中有3個糖基化位點與番鴨細小病毒(MDPV)相同。在氨基酸序列方面，GPV與MDPV在440—530位的變化較大，在結構蛋白中的443—445位上GPV為NFN，在MDPV上則是NFS；在493—495位上GPV為NWN，相同位置MDPV為NWS。

4 小結及展望

目前，關于細小病毒致病機制研究雖然較多，但進展仍然較慢。細小病毒因其自身條件限制，主要選擇侵害宿主體內(nèi)分化較快、分裂迅速的組織，其中包括新生組織、胎兒及胎兒新生組織及成年動物的淋巴系統(tǒng)。在成年動物的淋巴系統(tǒng)中，腸上皮組織含有極多的分裂細胞源，由此成為細小病毒的主要感染目標。在細小病毒致病機制研究中，可考慮對宿主體內(nèi)分化較快、分裂迅速的組織及細胞內(nèi)病毒作用進行研究。在PPV致病機制試驗中，可對PK-15細胞的作用多加研究。通過研究發(fā)現(xiàn)糖基化位點對病毒和宿主細胞的吸附產(chǎn)生影響，由此可推測，糖基化位點的差異與病毒感染宿主的特異性有密切關聯(lián)。在研究細小病毒致病機制方面，應對以上內(nèi)容加以深入探討。目前，隨著寵物數(shù)量的急劇增長，寵物疾病也逐漸得到重視，而作為患病數(shù)較多、危害較高的細小病毒流行也日益廣泛，為找到高效安全的預防和治療手段，細小病毒致病機制的研究體現(xiàn)了極大的重要性。