尹聶生

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師二十一團(tuán)畜牧中心841111）

孕馬血清促性腺激素（PMSG）也叫馬絨毛膜促性腺激素，是從懷孕早期的母馬血清中提取出的一種促性腺激素。隨著近年來不斷深入分析高新生物技術(shù)，PMSG最開始在動(dòng)物誘導(dǎo)發(fā)情、人畜生殖器官疾患與超數(shù)排卵治療中廣泛應(yīng)用。目前在生物工程技術(shù)領(lǐng)域得到應(yīng)用，如細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎移植。因此，PMSG市場(chǎng)需求量越來越大，市場(chǎng)生產(chǎn)規(guī)模越發(fā)不能滿足，原材料供應(yīng)不足占據(jù)主導(dǎo)原因。本試驗(yàn)旨在研究孕馬血清采集與分離的有效方法，為提取高效價(jià)、較高純度的PMSG成品提供原材料。

1 孕馬血清采集與分離工藝流程

1.1 工藝流程

檢疫合格的馬匹→受孕→確定受孕→試血（效價(jià)檢測(cè)）→采血（采血針頭、導(dǎo)引管、采血瓶、血清瓶等滅菌準(zhǔn)備）→離心→分離、配制還輸液（葡萄糖生理鹽水還輸液滅菌準(zhǔn)備）→血清→加防腐劑、取樣檢測(cè)、無菌試驗(yàn)→入庫→馬匹休息→進(jìn)入下次采血。

1.2 具體操作方法

1.2.1 孕馬檢查

在孕馬妊娠40d時(shí)進(jìn)行檢查，高峰數(shù)值出現(xiàn)在60d時(shí)，隨后維持到大約第120天開始降低。畜牧技術(shù)員需要對(duì)準(zhǔn)母馬妊娠天數(shù)進(jìn)行了解，對(duì)馬號(hào)及妊娠天數(shù)進(jìn)行記錄。

1.2.2 試血

采集摸排好妊娠馬匹頸靜脈血液進(jìn)行檢測(cè)。選擇ELISA法對(duì)血清開展測(cè)定以及對(duì)效價(jià)進(jìn)行確定，對(duì)合格馬匹進(jìn)行編號(hào)之后才可以采血。

1.2.3 采血

孕馬保定之后對(duì)頸部皮膚利用75%酒精棉球檫拭與碘伏進(jìn)行消毒，找準(zhǔn)頸動(dòng)脈血管，用采血針頭插入，將膠管的一端與針頭鏈接，另一端伸入離心瓶中，緊貼瓶壁。離心瓶按1OOOml血液加入20ml20%的枸櫞酸鈉的比例抗凝，并記下瓶號(hào)，瓶蓋蓋上后傾斜離心瓶大約45°之后進(jìn)行緩慢搖轉(zhuǎn)，保障注射液全面覆蓋離心瓶的內(nèi)壁；將靠近心端止血鉗取出，經(jīng)采血管流血液進(jìn)入到離心瓶，接滿血后蓋上瓶蓋；采血過程需要嚴(yán)格消毒，處理采血針頭、還輸瓶、離心瓶、膠管等器具，避免發(fā)生污染。還輸瓶、離心瓶編號(hào)需要與采血馬匹的編號(hào)要進(jìn)行對(duì)應(yīng)，將記錄工作做好。

注意事項(xiàng)：（1） 依據(jù)1000ml血液融入20ml20%枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝，實(shí)際上就是建設(shè)等滲環(huán)境，不會(huì)改變血液滲透壓，也不會(huì)破壞紅細(xì)胞導(dǎo)致發(fā)生溶血。（2）在38℃水浴箱內(nèi)促使接血瓶中血液進(jìn)行均勻受熱，析出不穩(wěn)定蛋白，促進(jìn)離心、析出血清，血清采集之后外觀呈現(xiàn)出透亮且黃色的現(xiàn)象。

1.2.4 離心

將接滿血的離心瓶按先后順序放置于38℃水浴箱中，間隔10min進(jìn)行一次觀察，0.5h之后間隔5min進(jìn)行一次觀察，直到開始析出血清時(shí)取出；自水浴箱中將離心瓶取出之后放置于離心機(jī)中，分離速度為每分鐘4000轉(zhuǎn)，進(jìn)行25～30min的離心，此時(shí)黃色透亮的血清大量析出，將血清緩緩倒入加過防腐劑的存儲(chǔ)器中迅速封裝并置于-2～-8℃的冷庫加以保存。

1.2.5 對(duì)采過血的馬匹進(jìn)行血球還輸

將事先配置好的葡萄糖生理鹽水與相對(duì)應(yīng)馬匹的血漿置于還輸瓶?jī)?nèi)（配置的量為采血量），將膠管的一端與針頭鏈接，另一端伸入離心瓶中，找準(zhǔn)頸動(dòng)脈血管，將針頭刺入并舉起還輸瓶輸完為止。

注意事項(xiàng)：對(duì)采集過血的馬匹須立即做血球還輸能降低損傷馬匹血球細(xì)胞的程度，減少孕馬死亡率，提升采血次數(shù)與采血量，提高馬匹免疫力、馬駒成活率。

1.2.6 采血后管理

馬匹休息并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，準(zhǔn)備下次采血。

2 采血孕馬的管理技術(shù)要點(diǎn)

2.1 添加適當(dāng)精料

采血前后對(duì)孕馬的飼養(yǎng)管理既要保證孕馬本身營養(yǎng)良好，又要兼顧胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、胎兒不流產(chǎn)、分娩順利。孕馬膘度在中上的進(jìn)行采血，膘度較差的禁止采血。所以，此時(shí)對(duì)孕馬除了加強(qiáng)放牧（農(nóng)區(qū)要多給些優(yōu)質(zhì)青干草）以外，還要提供蛋白質(zhì)含量較高的精料。通過試驗(yàn)研究，采血的孕馬要從確定懷孕后就開始添加精料，添加量為2.5kg/d（添加的過多，收益不明顯，浪費(fèi)成本），精料種類為豆粕、玉米和全價(jià)料， 其比重為 3∶5∶8。

2.2 采血次數(shù)、間隔時(shí)間及采血量

通過試驗(yàn)表明，孕馬從妊娠40～120d時(shí)采血最適。滿膘的孕馬采血次數(shù)可控制在10次，間隔8d采血一次，次采血量控制在5kg；中上膘度的孕馬采血次數(shù)應(yīng)控制在8次，間隔10d采血一次，次采血量為4.5kg。這樣既可充分發(fā)揮和利用采血期間的孕馬，使其產(chǎn)生的效益最大化，又可以保護(hù)孕馬本身及其胎兒不受影響。

2.3 注射適量含鐵制劑

為了使孕馬在采血后能及時(shí)恢復(fù)自身血容量，最大限度的恢復(fù)自身體況及保護(hù)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，并不影響下次采血量，孕馬除了發(fā)揮自身正常的造血功能外，還需人為注射適當(dāng)?shù)暮F制劑-右旋糖酐鐵VB12注射液。孕馬在每次采血后，根據(jù)孕馬膘度情況按照每千克體重肌肉注射0.1～0.12ml右旋糖酐鐵VB12注射液，膘度好可提高用量，反之亦然。切忌超量使用，否則產(chǎn)生不良反應(yīng)帶來不必要的損失。