馮定慶，閆克芹，張 筱，鄧 琳，凌 斌

中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100029

Piwil2屬于PIWI/AGO家族，位于人類第8號(hào)染色體，在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和生殖干細(xì)胞(germline stem cells，GSCs)中廣泛表達(dá)，對(duì)干細(xì)胞自我更新和分化具有重要的調(diào)控作用［1-2］。出生后的正常個(gè)體，Piwil2僅表達(dá)于睪丸生精細(xì)胞，其他組織均未見表達(dá)，而在各種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系可見Piwil2重新表達(dá)，被認(rèn)為是一種新的腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen，CAT)［3-5］。我們的前期研究結(jié)果顯示，在正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)1病變中未見Piwil2，CIN2-3病變及宮頸癌組織中重現(xiàn)Piwil2表達(dá)［2］，并且Piwil2是宮頸癌干細(xì)胞一個(gè)重要的分子標(biāo)志［6］。進(jìn)一步的研究證實(shí)，Piwil2通過表觀遺傳途徑促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子c-myc、nanog、sox2和oct4表達(dá)而啟動(dòng)細(xì)胞重編程［2］。然而，Piwil2表達(dá)與宮頸癌惡性生物學(xué)行為及腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系，目前尚不清楚。

本研究試圖通過在宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa中分別沉默和過表達(dá)Piwil2，觀察細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的改變，并深入探討其可能的分子機(jī)制，以期進(jìn)一步完善宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，并為宮頸癌的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高糖DMEM、RPMI-1640、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、TRIzol試劑盒、LipofectamineTM3000、蛋白酶抑制劑混合物、BCA蛋白定量試劑盒和ECL顯色試劑盒均購自美國ThermoFisher公司，碘化吡啶(propidium iodide，PI)、RNase A、Hoechst 33342、嘌呤霉素和維拉帕米(verapamil)購自美國Sigma公司，慢病毒載體pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP、對(duì)照病毒pLenti-EGFP購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，shPiwil2質(zhì)粒(TG302470)、隨機(jī)序列shRNA質(zhì)粒(TR30013)購自美國OriGene公司，Random Primer、反轉(zhuǎn)錄酶和PCR試劑盒Premix Taq均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，順鉑(規(guī)格20 mL：20 mg)由南京制藥廠有限公司提供，CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，Stat3(#9132)、p-Stat3(#9145)和GAPDH(#2118)一抗購自美國Cell Signaling公司，Piwil2(ab85084)一抗購自美國Abcam公司，P53(BM0102)和cyclin D1(BA0770)一抗購自武漢博士德生物工程有限公司，所有二抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，高糖DMEM(含10%FCS、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素)、于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)。① 過表達(dá)Piwil2：收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，1×104個(gè)細(xì)胞接種6孔板，6 h后細(xì)胞貼壁，過表達(dá)Piwil2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLenti-EGFP；② 沉默Piwil2表達(dá)：收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，5×103個(gè)細(xì)胞接種96孔板；第2天，采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染shPiwil2質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列shRNA質(zhì)粒，1 μg/ mL嘌呤霉素壓力篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；熒光觀察、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染效果。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)［2］，對(duì)照病毒pLenti-EGFP和隨機(jī)序列shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)Piwil2表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)特性均無顯著影響，故將轉(zhuǎn)染前的HeLa和SiHa細(xì)胞作為相應(yīng)的統(tǒng)一對(duì)照。

1.3 反轉(zhuǎn)錄及PCR

收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)TRIzol充分裂解后提取總RNA并定量，取2 μg總RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書操作獲得cDNA；取1 μL cDNA、上下游引物各1 μL、Premix Taq 12.5 μL、去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃解鏈1 min，94 ℃ 30 s、56 ℃30 s、72 ℃ 45 s，共34個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、觀察結(jié)果。其中，PCR引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列見表1。

表 1 PCR引物序列Tab. 1 PCR primer sequence

1.4 細(xì)胞增殖的檢測

收集對(duì)數(shù)生長期HeLa和SiHa細(xì)胞，每100 μL 2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，分別于接種后24、48、72和96 h向各孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，振蕩混勻(不可產(chǎn)生氣泡)，酶標(biāo)儀上讀取450 nm處吸光度(D)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞周期檢測

收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將1×106個(gè)細(xì)胞加入預(yù)冷70%乙醇1 mL，于-20 ℃溫度下固定過夜。預(yù)冷1×PBS洗滌細(xì)胞2次，15 000×g離心5 min，棄上清液。50 μg/ mL PI(含250 μg/mL RNase A，0.02% Triton X-100)500 μL重懸細(xì)胞，室溫避光染色30 min，并采用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescent-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)進(jìn)行檢測。

1.6 側(cè)群(side polulation，SP)細(xì)胞檢測

腫瘤組織中的SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)特性，通過細(xì)胞膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將熒光染料Hoechst 33342外排而發(fā)生拒染，維拉帕米則可阻斷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能；SP細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。為探討Piwil2表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例的影響，分別收集HeLa、SiHa及相應(yīng)沉默和過表達(dá)Piwil2細(xì)胞，每組細(xì)胞分為2份，含2%FCS RPMI-1640重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。加入終濃度為5 μg/ mL Hoechst 33342，其中一份細(xì)胞同時(shí)加入100 mmol/L維拉帕米，37 ℃避光水浴90 min(期間，每隔15 min輕微振蕩數(shù)秒)。冰上10 min終止染色，含2%FCS預(yù)冷的RPMI-1640洗滌、重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測前加入終濃度為2 μg/mL PI。355 nm UV激發(fā)光，610 nm雙色短通反射濾鏡，450和675 nm下分別檢測藍(lán)光和紅光，分析SP細(xì)胞比例。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)

1%NP40(含蛋白酶抑制劑和PMSF)裂解細(xì)胞提取總蛋白，取40 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE分離，15 V 20 min半干轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶封閉2 h，一抗4℃溫育過夜，TBST洗滌后加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫溫育2 h，TBST洗滌、ECL顯色、凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.8 順鉑敏感性檢測

收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，1×104個(gè)細(xì)胞接種96孔板，6 h后分別加入連續(xù)梯度濃度的順鉑(0～24 μg/mL)，48 h后采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，繪制順鉑殺傷曲線，比較HeLa和SiHa細(xì)胞過表達(dá)/沉默Piwil2基因后對(duì)順鉑的敏感性變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Piwil2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖

HeLa和SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒載體pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP，48 h后熒光顯微鏡下可見EGFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上；宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染shPiwil2質(zhì)粒，采用1 μg/mL嘌呤霉素持續(xù)壓力篩選2周后，可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在HeLa和SiHa細(xì)胞Piwil2過表達(dá)和沉默效果均良好(圖1A、B)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Piwil2顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而沉默Piwil2基因后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖則被顯著抑制(P＜0.01，圖1C、D)。

圖 1 過表達(dá)和沉默Piwil2基因?qū)m頸癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 1 The over-expression and silencing of Piwil2 gene affected cervical cancer cell lines proliferation

2.2 Piwil2影響宮頸癌細(xì)胞周期

細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞G0/ G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例平均分別為58.92%、37.58%和3.50%，過表達(dá)Piwil2后，G0/ G1期細(xì)胞比例(47.09%)顯著減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例(45.64%和7.27%)顯著增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)；沉默Piwil2基因后，則G0/G1期細(xì)胞比例(66.84%)顯著增加，沉默前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。SiHa細(xì)胞過表達(dá)和沉默Piwil2基因后，G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例變化趨勢與HeLa細(xì)胞一致。結(jié)果表明，Piwil2加快了宮頸癌細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，沉默Piwil2基因則使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯(圖2)。

2.3 細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)

進(jìn)一步分析Piwil2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，Western blot結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞過表達(dá)Piwil2后，Stat3磷酸化水平增加，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1表達(dá)增加，P53的表達(dá)水平則顯著降低；沉默Piwil2基因表達(dá)，則結(jié)果相反。過表達(dá)和沉默Piwil2基因前后，Stat3表達(dá)無顯著變化(圖3)。

2.4 Piwil2上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例

FACS結(jié)果顯示，HeLa和SiHa細(xì)胞SP細(xì)胞比例分別為3.01±0.30和2.07±0.21，過表達(dá)Piwil2后，SP細(xì)胞比例均顯著增加(6.28±0.52和4.20±0.50)，而沉默Piwil2基因表達(dá)則顯著降低了SP細(xì)胞比例(1.03±0.20和1.14±0.31)，與對(duì)照組細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4)。

2.5 Piwil2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞耐藥

HeLa細(xì)胞及其沉默、過表達(dá)Piwil2基因后，順鉑對(duì)它們的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)分別為4.78、3.52和8.97 μg/mL，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05和P＜0.01，圖5A)。SiHa細(xì)胞及沉默、過表達(dá)Piwil2基因后，順鉑LD50值分別為10.21、6.06和18.64 μg/mL，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖5B)。

圖 2 FACS檢測HeLa和SiHa細(xì)胞過表達(dá)或沉默Piwil2后細(xì)胞周期變化Fig. 2 The cell cycle of HeLa and SiHa was analyzed by FACS

圖 3 Westorn blot檢測pStat3、cyclin D1和P53的表達(dá)Fig. 3 The expression levels of pStat3, cyclin D1 and P53 measured by Western blot

3 討 論

Piwil2正常表達(dá)于ESCs和GSCs，而作為一種CAT，在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)主要在其中的癌前干細(xì)胞(precancerous stem cells，pCSCs)和CSCs群體中，Piwil2已經(jīng)被認(rèn)為是pCSCs/CSCs特異標(biāo)志物之一［2,6,8-9］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV致癌蛋白E6/E7能夠重啟Piwil2表達(dá)，繼而通過表觀遺傳途徑使體細(xì)胞發(fā)生重編程，促進(jìn)腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells，TICs)形成，在宮頸癌發(fā)生中起重要作用［2］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HeLa和SiHa細(xì)胞過表達(dá)Piwil2后，群體中SP細(xì)胞比例顯著增加，而沉默Piwil2基因則顯著降低SP細(xì)胞比例，再一次驗(yàn)證了前期的研究結(jié)果。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源，宮頸癌的進(jìn)展程度與Piwil2表達(dá)水平密切相關(guān)。

Piwil2具有強(qiáng)大的基因表達(dá)調(diào)控功能，通過piRNA結(jié)合目標(biāo)mRNA，Piwil2可發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的功能降解mRNA［1，10］；Piwil2還可以募集HP1、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等，通過表觀遺傳修飾途徑調(diào)控基因表達(dá)［11-13］；Piwil2還可以與微核糖核蛋白粒子(micro ribonucleoprotein particle，miRNP)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用［13］。宮頸癌細(xì)胞過表達(dá)Piwil2后，p53蛋白水平顯著降低，cyclin D1表達(dá)上調(diào)，并且Stat3的磷酸化水平也顯著增加，沉默Piwil2基因則效果相反。p53、cyclin D1、pStat3參與調(diào)控細(xì)胞周期，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［14-16］。這些基因表達(dá)的改變，正好是Piwil2調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期變化的分子基礎(chǔ)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Piwil2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，顯著增加S期和G2/M期細(xì)胞比例，沉默Piwil2基因則引起細(xì)胞脫離細(xì)胞周期、阻滯于G0/G1期、從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

圖 4 FACS檢測Piwil2表達(dá)對(duì)HeLa和SiHa細(xì)胞中SP細(xì)胞比例的影響Fig. 4 Identification of SP cells and analyses the proportion with FACS

圖 5 Piwil2對(duì)HeLa和SiHa細(xì)胞順鉑殺傷敏感性的影響Fig. 5 Piwil2 affected the sensitivity of HeLa and SiHa cells to cisplatin

另外，化療藥物殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Piwil2還可以引起HeLa和SiHa細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低，促進(jìn)化療藥物抵抗。分析原因，可能與Piwil2促進(jìn)SP細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高了SP細(xì)胞比例有關(guān)，以及與Piwil2顯著提高腫瘤細(xì)胞增殖活性、抑制細(xì)胞凋亡、上調(diào)耐藥基因表達(dá)等因素有一定關(guān)系［2,6,17］。相反，沉默Piwil2基因則顯著降低腫瘤細(xì)胞LD50值，顯著提升順鉑的殺傷效率。

因此，Piwil2的表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展及耐藥中發(fā)揮重要作用，Piwil2有望成為一個(gè)潛在的宮頸癌治療靶點(diǎn)。

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