張定煌，周伊薇，李盛安，包江橋，馮敏鈴，賀鴻志

(1.中山市農(nóng)業(yè)科技推廣中心，廣東中山 52840；2.廣東省現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)與循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642；3.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，廣東中山528401)

固氮藍(lán)藻是能進(jìn)行固氮作用的藍(lán)藻的總稱[1]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的固氮藍(lán)藻有150余種，是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的微生物資源[1-2]。固氮藍(lán)藻在生物肥料、生物農(nóng)藥、功能食品、新藥物、新能源、新材料、污染修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。1939年印度首次報道用固氮藍(lán)藻肥田，之后許多研究證明稻田接種固氮藍(lán)藻可增產(chǎn)[3]。目前隨著對固氮藍(lán)藻應(yīng)用基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面的發(fā)展，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力正在得到更全面和深入的認(rèn)識，而其在農(nóng)業(yè)環(huán)境污染修復(fù)、農(nóng)業(yè)病蟲害防治、農(nóng)業(yè)廢棄物利用等方面的應(yīng)用也成為了目前的熱點[2]。固氮藍(lán)藻可以產(chǎn)生大量性質(zhì)各異的次級代謝物，已有部分藻源化合物在醫(yī)學(xué)方面得到商業(yè)化應(yīng)用，但固氮藍(lán)藻可能仍然有天然活性成分尚待發(fā)掘和利用。鑒于此，筆者采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對5株稻田固氮藍(lán)藻產(chǎn)生的胞內(nèi)胞外揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，以評估其應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1材料試驗所用5株分離自稻田、具有異形胞的絲狀固氮藍(lán)藻為Nostocsp.(FACHB-85)、Nostocpaludosum(FACHB-89)、Nostocsp.(FACHB-131)、Anabaenaoryzae(FACHB-604)、Anabaenaazotica(FACHB-119)，均購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。藻培養(yǎng)試驗采用BG11無氮培養(yǎng)基。所有化學(xué)試劑均為分析純，試驗用水為超純水，所用萃取溶劑均為色譜純。

1.2方法

1.2.1藻培養(yǎng)方法。在500 mL玻璃三角瓶中加入BG11無氮培養(yǎng)基200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，無菌條件下接種10 mL對數(shù)生長期的藻種。在光照培養(yǎng)箱、溫度28.5 ℃、光照3 000 lx條件下培養(yǎng)，每天搖瓶3～6次，共培養(yǎng)14 d(對數(shù)生長后期)。

1.2.2藻培養(yǎng)液和藻細(xì)胞揮發(fā)物提取。采用離心法分離藻細(xì)胞和培養(yǎng)液，離心獲得上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后加入20 mL色譜純乙酸乙酯，在搖床上避光振搖1 h。將混合液轉(zhuǎn)移到250 mL分液漏斗中，靜置，分層后進(jìn)行分液，保留乙酸乙酯相，加無水硫酸鈉除去水分后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，加色譜純乙酸乙酯定容至2 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后即可用于氣相色譜-質(zhì)譜分析。上述離心獲得的藻細(xì)胞凍干后，加入20 mL色譜純乙酸乙酯，在搖床上密封避光振搖24 h。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，用無水硫酸鈉除水，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加乙酸乙酯定容至2 mL，濾膜過濾后用于分析。

1.2.3氣相色譜-質(zhì)譜測定條件和方法。HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；柱流速為1.0 mL/min；載氣：高純氦氣；程序升溫：70 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速度升溫至280 ℃，保持15 min；質(zhì)譜條件：離子源230 ℃，四極桿150 ℃；離子源及電壓：EI源70 eV；質(zhì)量掃描范圍：40～500 m/z；檢索譜庫：NIST14.L。

2 結(jié)果與分析

2.1藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌揮發(fā)物分析用色譜純乙酸乙酯萃取獲得了藻細(xì)胞培養(yǎng)液中揮發(fā)性物質(zhì)，其代表性的GC-MS分析圖譜見圖1。由圖1可知，胞外液有20多個較大的色譜峰。經(jīng)質(zhì)譜分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫匹配后的結(jié)果見表1(僅選擇匹配度超過80%的物質(zhì))。由表1可知，F(xiàn)ACHB-85、FACHB-89、FACHB-131、FACHB-604和FACHB-119確認(rèn)出現(xiàn)的揮發(fā)物分別有11、13、9、7和7個?；衔镱愋椭饕ㄍ闊N類、鹵代烴類、硅烷類、酚類和酯類。其中，2，4-二叔丁基酚、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二仲丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二(2-乙基己基)酯、鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯在5株藻的胞外液中均有出現(xiàn)。

圖1 培養(yǎng)液中揮發(fā)物代表性色譜圖(FACHB-89)Fig.1 A representative chromatography of volatiles in algal culture filtrate(FACHB-89)

按照色譜峰面積占比，念珠藻FACHB-85和FACHB-89的培養(yǎng)濾液中出現(xiàn)的主要物質(zhì)均為鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯，其次為鄰苯二甲酸二丁酯，這2種物質(zhì)之和分別占2種藻胞外分泌揮發(fā)物的94%和85%以上。但同為念珠藻屬的FACHB-131卻與這兩者存在很大差異，而與魚腥藻屬的FACHB-119非常接近，主要物質(zhì)為鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二(2-乙基己基)酯和2，4-二叔丁基酚。FACHB-604則主要是鄰苯二甲酸二異丁酯，占91.2%。

表1 藻培養(yǎng)濾液中揮發(fā)物的氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2藻細(xì)胞中的揮發(fā)物分析用色譜純乙酸乙酯萃取獲得了藻細(xì)胞中的揮發(fā)性物質(zhì)，其代表性的GC-MS分析圖譜見圖2。由圖2可知，細(xì)胞提取液也有20多個較大的色譜峰。經(jīng)質(zhì)譜分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫匹配后的結(jié)果見表2(僅選擇匹配度超過80%的物質(zhì))。由表2可知，F(xiàn)ACHB-85、FACHB-89、FACHB-131、FACHB-604和FACHB-119確認(rèn)出現(xiàn)的揮發(fā)物分別有10、9、11、9和7個?；衔镱愋椭饕ü柰轭悺⑼闊N類、酯類和酰胺類，這與培養(yǎng)液中的結(jié)果有較大的差別。

圖2 藻細(xì)胞中揮發(fā)物代表性色譜(FACHB-131)Fig.2 A representative chromatography of volatiles in algal cells(FACHB-131)

2.3藻產(chǎn)揮發(fā)物活性成分應(yīng)用潛力評估將試驗獲得的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步分析以評估可能的活性成分，結(jié)果見表3。由表3可知，國內(nèi)外研究已經(jīng)證實的活性物質(zhì)主要包括烷烴類、酚類、脂類和硅烷類共計9種物質(zhì)。其中烷烴類為十七烷和7-甲基-十七烷，兩者均具有抗病原微生物的作用[4]，而7-甲基-十七烷可以作為性信息素[7]。酚類為2，4-二叔丁基酚，具有抗植物病害、抑制有害生物膜、抗草、抗菌、抗氧化、殺蟲等多重作用[8-17]，特別是近年來其在破壞有害生物膜方面的作用引起廣泛關(guān)注[8-11]。在酯類方面，其主要的活性作用為抑制有害藻類，如水華藻微囊藻和赤潮藻短凱倫藻[18-21]。同時，部分具有抗作物病害的作用[22-25]。而鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯甚至具有一定的抗蟲作用[26]。這都說明雖然作為塑化劑的主要成分的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)被認(rèn)為是環(huán)境污染物質(zhì)，但在某些條件下可作為生物源殺藻劑和農(nóng)藥使用。已經(jīng)有研究表明，很多淡水藻類均能產(chǎn)生鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，可以在脅迫條件下釋放到環(huán)境中[27]。此外，硅烷中十八甲基環(huán)九硅氧烷被認(rèn)為可能具有抗菌活性[23]。

表2 藻細(xì)胞中揮發(fā)物氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

表3 藻產(chǎn)揮發(fā)物活性成分應(yīng)用潛力評估

3 結(jié)論

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析方法對5株稻田固氮藍(lán)藻的揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行分析與鑒定。結(jié)果表明，固氮藍(lán)藻揮發(fā)性成分中有多種生物活性功能的烷烴、酚類和酯類物質(zhì)，具有抗動植物病原微生物、抑制有害藻類、抗草、殺蟲等作用，說明稻田固氮藍(lán)藻在生物源藥物、殺藻劑和農(nóng)藥等生產(chǎn)方面具有應(yīng)用價值。

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科技論文寫作規(guī)范——數(shù)字

公歷世紀(jì)、年代、年、月、日、時刻和各種計數(shù)和計量，均用阿拉伯?dāng)?shù)字。年份不能簡寫，如1990年不能寫成90年，文中避免出現(xiàn)“去年”“今年”等寫法。小于1的小數(shù)點前的零不能省略，如0.245 6不能寫成.245 6。小數(shù)點前或后超過4位數(shù)(含4位數(shù))，從小數(shù)點向左右每3位空半格，不用“，”隔開。如18 072.235 71。尾數(shù)多的數(shù)字(5位以上)和小數(shù)點后位數(shù)多的小數(shù)，宜采用×10n(n為正負(fù)整數(shù))的寫法。數(shù)字應(yīng)正確地寫出有效數(shù)字，任何一個數(shù)字，只允許最后一位存在誤差。