羅雪婷，吳 迪，潘洪吉，張寶常，王艷輝，張希躍，矯 健

(1.北京市植物保護站，北京 100029；2.北京市平谷區(qū)植物保護站，北京 101205)

圖1 戊唑醇結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structure of tebuconazole

戊唑醇(Tebuconazole)是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性的三唑類殺菌農(nóng)藥(結(jié)構(gòu)式見圖1[1])，具有保護、治療、鏟除三大功能，目前在我國18種作物上取得登記[2]并廣泛應用。其殺菌機理主要是抑制病原菌的麥角甾醇的生物合成，可以防治白粉菌屬、柄銹菌屬、喙孢屬、核腔菌屬和殼針菌屬引起的病害。其殺菌性能與三唑酮相似，生物活性比三唑酮、三唑醇高，表現(xiàn)為用藥量低[3]。然而，戊唑醇對肝臟與血液系統(tǒng)有一定的蓄積毒性[4]，還可能是一種非遺傳毒性的動物致癌物[5]。戊唑醇對大鼠的急性經(jīng)口LD50約為4 000 mg/kg，對雌、雄小鼠的急性經(jīng)口LD50分別為3 933和2 000 mg/kg，對大鼠的急性經(jīng)皮LD50>5 000 mg/kg[1]。因此，確定戊唑醇在蘋果中的殘留消解動態(tài)有非常重要的作用。

戊唑醇隨著應用范圍的擴大以及使用頻率、用量、面積的增加，農(nóng)藥殘留問題也日益凸顯，尤其是近年來在蘋果上登記使用防治蘋果斑點落葉病的企業(yè)逐漸增多。為了保證消費者的安全，筆者根據(jù)現(xiàn)狀對戊唑醇在蘋果及土壤殘留檢測的方法進行了探索，并對其殘留消解動態(tài)進行了研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗品種。蘋果(富士)。

1.1.2藥劑與試劑。80%戊唑醇水分散粒劑(廣西貝嘉爾生物化學制品有限公司)；乙腈、丙酮、環(huán)己烷、乙酸乙酯均為色譜純，購自迪馬公司；N-丙基乙二胺(PSA)，購自迪馬公司；戊唑醇標準品：純度99.5%，購自迪馬公司；溴氰菊酯標準品：純度99.5%，購自迪馬公司；滅螨猛標準品：純度99.0%，購自迪馬公司；有機微孔過濾膜(孔徑0.22 μm)，由Agilent公司生產(chǎn)。

1.1.3儀器。GPC-GC/MS 2010Ultra在線凝膠色譜串聯(lián)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；高速組織搗碎機(德國 IKA T18)；恒溫振蕩器(培英 DDH7-300)；氮氣吹干儀(美國Organomation Associates Jnc)；臺式高速離心機(轉(zhuǎn)速不低于5 000 r/min，長沙英泰儀TG16)；分析天平(感量0.01 g和0.000 01 g，德國sartoriusBP211D)。

1.2方法

1.2.1提取。稱取20.00 g蘋果樣品，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下勻漿提取1 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，8 000 r/min離心5 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.2凈化。移取8 mL上清液于15 mL離心管中，加入0.2 g PSA，劇烈振蕩1 min，將離心管放入離心機中，8 000 r/min離心5 min。吸取4 mL乙腈溶液置于5 mL離心管中，將離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度40 ℃條件下氮吹蒸發(fā)至近干(0.2 mL左右)，用乙酸乙酯定容至1.0 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待GPC-GC/MS檢測。

1.2.3儀器分析條件。

1.2.3.1GPC條件。色譜柱:ShodexCLNpak EV-200， 2.1 mm(直徑)×150 mm；流動相:丙酮-環(huán)己烷混合溶液(3+7,V/V)；流速0.1 mL/min；柱溫:40 ℃；進樣量:10 μL。

1.2.3.2GC-MS條件。HP-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；PTV進樣模式；進樣口溫度程序： 120 ℃保持5 min，再以100 ℃/min速度升溫至250 ℃并保持 31.7 min ；柱溫程序：2 ℃保持5 min，再以8 ℃/min升溫至300 ℃并保持4.2 min；載氣：He；電子轟擊源(EI)；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描開始時間：24 min，結(jié)束時間：32 min；掃描范圍(m/z) 85～500。保留時間：27.174 min；選擇離子：250、252、127、163。

1.3消解動態(tài)試驗

1.3.180%戊唑醇水分散粒劑在蘋果中的消解動態(tài)試驗。選取蘋果園內(nèi)有代表性的地塊，設(shè)3個重復試驗小區(qū)，每小區(qū)面積20 m2，施藥時期為蘋果生長到成熟個體一半大小時施藥，施藥時應保證用于動態(tài)試驗的蘋果均勻著藥。施藥劑量為有效成分480 mg/kg(1 667倍稀釋液)處理，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d取樣。每個處理3次重復，處理間設(shè)保護隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對照。隨機在試驗小區(qū)上、下、左、右不同部位采集12個(不少于2 kg)已著藥、生長正常、無病害的果實，去梗，混勻后縮分，留250 g樣品2份，分別裝入封口樣品容器中，于-20 ℃冰箱保存待測。

1.3.280%戊唑醇水分散粒劑在土壤中的消解動態(tài)試驗。選一塊20 m2的地塊，單獨施藥，施藥劑量為有效成分480 mg/kg(1 667倍稀釋液)，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d取樣。另設(shè)清水空白對照。隨機取點10～12個，用土鉆采集0～10 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣300 g，裝入封口樣品容器中，粘好標簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇按溶劑類型劃分，目前農(nóng)殘?zhí)崛》ㄖ饕?種：第1種是乙腈法，美國、加拿大等國應用最早、最多；第2種是丙酮法，20世紀中后期在我國廣泛應用；第3種是乙酸乙酯，歐盟國家及FAO、IAEA等機構(gòu)使用很多。就農(nóng)藥提取效率來說，乙腈、丙酮、乙酸乙酯3種試劑中最優(yōu)的為乙腈，丙酮毒性很低且是一種典型的溶劑，但是由于其極性較強，提取的雜質(zhì)較多，為下一步凈化帶來困難，乙酸乙酯由于分子量較大，穿透力沒有乙腈強[6]。戊唑醇的提取效果沒有乙腈好，結(jié)合以上幾點，試驗最終選取乙腈為提取液。

2.2凈化方法的選擇QuEChERS方法是近年來國際非常流行的一種通用前處理方法，在2003年,Anastassiades等[7]首次報道了“QuEChERS方法” (Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe),該方法能夠快速、簡便、高質(zhì)量地對農(nóng)藥多殘留進行分析。國內(nèi)殘留檢測中最早應用QuEChERS法的研究出現(xiàn)在2005年[8]。目前，已有200 余種農(nóng)藥殘留可用該方法進行分析,其中包括含脂肪的介質(zhì)體系[9-12]。QuEChERS方法將凈化劑直接加入到提取液中,與傳統(tǒng)的固相萃取法相比不僅節(jié)省溶劑,減少環(huán)境污染，同時也節(jié)約了大量的前處理時間。

試驗以QuEChERS方法為基礎(chǔ)，根據(jù)蘋果相對糖分色素較多，機制復雜，結(jié)合檢測效率，對QuEChERS方法進行了改良。對預處理后的樣品經(jīng)乙腈提取后，采用氯化鈉鹽析分層后，利用基質(zhì)分散萃取機理，采用PSA吸附劑吸附基質(zhì)中絕大部分干擾物(色素、糖分、有機酸、脂肪酸、碳水化合物等)，從而達到凈化的目的。這樣的前處理方式既滿足了檢測的需求，而且大大提高了檢測速度，并且節(jié)約了大量的勞動成本。

2.3最終定容試劑的選擇為了提高檢出限，試驗使用濃縮的處理方式，定容試劑選擇乙酸乙酯，由于乙酸乙酯對糖和水的溶解度小于乙腈，在最終定容時進行溶劑轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)再一次凈化。另外，由于乙腈和該研究GPC使用的溶劑環(huán)己烷不互溶，會產(chǎn)生比較嚴重的溶劑效應。因此，在最終定容時，用乙酸乙酯定容，不僅對樣品進行了再一次凈化，而且有效地避免了溶劑效應。

2.4儀器分析方法的選擇目前有很多關(guān)于戊唑醇殘留檢測的方法，但前處理步驟相對較多，使用儀器大多為液相色譜、氣相色譜、氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀[13-22]，另見González-Rodríguez等[23]采用GC-ITMS和LC-MS/MS檢測葡萄釀酒過程中的戊唑醇殘留。

由于該研究所用前處理采用分散固相萃取凈化，凈化效果沒有傳統(tǒng)的SPE法好[24]，在應用氣相色譜-質(zhì)譜檢測時往往因出現(xiàn)襯管和柱前端嚴重污染而導致色譜峰丟失或拖尾、背景高、基質(zhì)效應嚴重，從而影響了一些農(nóng)藥的定性和定量檢測[25]。凝膠滲透色譜(GPC)能夠很好地去除樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)，如油脂、色素(葉綠素、葉黃素等)、生物堿、聚合物等大分子化合物，并已在農(nóng)藥殘留分析中得到廣泛應用[26]。因此，選擇GPC-GC/MS為檢測儀器。GPC-GC/MS在分析農(nóng)藥殘留時，在GPC色譜柱中根據(jù)體積排阻的原理將不同分子尺寸的物質(zhì)進行分離，樣品中分子量較大的脂肪和色素先從色譜柱中流出，通過六通閥的轉(zhuǎn)換將這些基質(zhì)干擾物排除系統(tǒng)，截取含有農(nóng)藥成分的部分導入試樣定量捕集環(huán)路(200 μL)，再進行PTV進樣和GC-MS分離檢測，實現(xiàn)了全自動的前處理儀器分析測定的在線分析。而合理的截取時間是影響目標農(nóng)藥定性和定量的關(guān)鍵，若截取時間過早，色素和油脂的去除效果降低，截取時間過晚，分子量大的目標農(nóng)藥丟失，所以在GPC-GC/MS分析中必須根據(jù)實際分析對象選擇最佳截取時間。該研究采用溴氰菊酯和滅螨猛標準品的保留時間來確定農(nóng)藥收集的開始和結(jié)束時間，需要測定的戊唑醇分子量為307.8，小于溴氰菊酯的分子量(505.2)[1]，所以采用溴氰菊酯的保留時間作為干擾物和分析對象的切割時間，圖2為優(yōu)化截取條件下農(nóng)藥的總離子流(TIC)色譜。此外，GPC-GC/MS系統(tǒng)的進樣量為10～20 μL，比單獨的GC-MS高5～10倍，樣品提取液經(jīng)分散固相萃取凈化后再利用在線GPC進一步去除干擾物質(zhì)，彌補了該研究所使用前處理去除干擾不徹底的缺陷，之后采用進樣口程序升溫的方式提高檢測靈敏度和選擇性，從而獲得更低的檢出限。

2.5質(zhì)譜掃描方式的選擇質(zhì)譜儀掃描方式有全掃描和選擇離子掃描2種。該研究采用全掃描定出目標物戊唑醇的保留時間。為了避免基質(zhì)干擾，提高檢出限，根據(jù)全掃的戊唑醇標品棒狀圖(圖3)定出戊唑醇的特征離子為250、252、127、125。

圖2 優(yōu)化截取條件下農(nóng)藥的總離子流(TIC)色譜Fig.2 TIC chromatographic of pesticide under optimized intercept condition

圖3 全掃的戊唑醇標品棒狀圖Fig.3 A bar chart of tebuconazole standard according to full scan

2.6標準曲線、線性范圍及檢出限稱取99.5%戊唑醇標準品10.70 mg，用乙酸乙酯溶解至10 mL，得到1 000 mg/L的母液。逐級稀釋，用空白基質(zhì)配制0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、5.000、10.000 mg/L系列標準溶液，在上述儀器條件下進行測定，以戊唑醇標準溶液濃度與其峰面積做標準曲線(圖4)。標樣線性方程為：y=1 362 381.0x+309 163.2，相關(guān)系數(shù)r=0.999。其中,y為戊唑醇響應值，x為標準溶液濃度。結(jié)果表明，戊唑醇標準溶液濃度在0.020～10.000 mg/L內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7靈敏度、準確度與精確度該方法對戊唑醇的最小檢出量為2×10-11g，在蘋果和土壤樣品中最低檢測濃度均為0.02 mg/L。分別在空白蘋果樣品中添加4檔濃度的戊唑醇標準溶液，每檔重復5次，用上述分析方法測定回收率。由表1、2

可知，蘋果和土壤中添加0.02、0.20、2.00和4.00 mg/kg， 回收率在75%～109%，相對標準偏差為3.1%～9.4%。

圖4 戊唑醇標準曲線Fig.4 The standard curve of tebuconazole

%

表2 土壤中戊唑醇的添加回收率

2.8方法凈化效果通過前處理和GPC-GC/MS儀器本身自帶的凈化功能相結(jié)合，處理蘋果、土壤空白樣品和添加樣品，在分析過程中排除了雜質(zhì)干擾，說明該方法有良好的凈化效果(圖5～8)。

圖5 蘋果空白樣品圖譜Fig.5 Spectrogram of apple blank sample

圖6 蘋果添加0.2 mg/kg戊唑醇樣品色譜Fig.6 Spectrogram of apple sample added 0.2 mg/kg tebuconazole

圖7 土壤空白樣品色譜Fig.7 Spectrogram of soil blank sample

圖8 壤添加0.2 mg/kg戊唑醇樣品色譜Fig.8 Spectrogram of soil sample added 0.2 mg/kg tebuconazole

2.9殘留消解動態(tài)結(jié)果戊唑醇在蘋果中的消解動態(tài)方程為Y=0.7e-0.05X，半衰期為13.9 d(表3)，消解動態(tài)曲線見圖9；戊唑醇在土壤中的消解動態(tài)方程為Y=0.279e-0.01X，半衰期為34.7 d(表4)，消解動態(tài)曲線見圖10。

表3 戊唑醇在蘋果中的消解動態(tài)

圖9 戊唑醇在蘋果中的消解動態(tài)曲線Fig.9 The dynamic curve of tebuconazole digestion in apple

3 結(jié)論與討論

試驗以傳統(tǒng)的QuEChERS前處理法為基礎(chǔ)，直接使用乙腈作為提取液，減少了酸對PSA除雜能力的影響。另外，除水采用了氯化鈉鹽析法替代了無水硫酸鎂，減少了因為無水

表4 戊唑醇在土壤中的消解動態(tài)

圖10 戊唑醇在土壤中的消解動態(tài)曲線Fig.10 The dynamic curve of tebuconazole in soil

硫酸鎂除水產(chǎn)生結(jié)塊并釋放大量熱量而對農(nóng)藥提取的損失；使用乙酸乙酯作為最終定容試劑進行溶劑轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)了再一次凈化，并且減少了GPC的溶劑效應；選用GPC-GC/MS作為檢測儀器，不僅提高了檢測靈敏度而且再一次進行了在線凈化。

我國規(guī)定蘋果中戊唑醇的MRL值為2.0 mg/kg[27]，在確保戊唑醇得到安全使用的前提下，采用80%戊唑醇水分散粒劑防治蘋果白腐病時，建議用量為48～75 mg/kg(4 000～6 000倍液)，噴霧施藥3～4次，施藥間隔7 d，推薦的安全間隔期為21 d。

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