陸玉建 石東里 吳濤

摘要：為探究氯化鎘（CdCl2）對本生煙草（Nicotiana benthamiana）幼苗生長及蛋白質(zhì)表達水平的影響，選用不同濃度的CdCl2處理本生煙草幼苗，測量其根長和莖長，提取本生煙草幼苗總蛋白質(zhì)，利用SDS-PAGE進行檢測。試驗結(jié)果表明，低濃度CdCl2對本生煙草幼苗的生長具有促進作用;高濃度CdCl2則抑制了本生煙草幼苗的生長。當CdCl2濃度達到0.5 mmol/L時，幼苗的生長開始受到抑制;CdCl2濃度大于1.5 mmol/L時，幼苗大量變黃枯萎。SDS-PAGE顯示，低濃度CdCl2可提高植物總蛋白質(zhì)的含量，而隨著CdCl2濃度的提高，本生煙草總蛋白質(zhì)的含量明顯下降。

關(guān)鍵詞：CdCl2;本生煙草（Nicotiana benthamiana）;幼苗;總蛋白質(zhì);SDS-PAGE

中圖分類號：S572? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.021? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of CdCl2 Treatment on the Growth and Protein Expression Level of

Nicotiana benthamiana Seedlings

LU Yu-jian，SHI Dong-li，WU Tao

（College of Biological and Environmental Engineering，Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，Shandong，China）

Abstract： In order to investigate the effects of CdCl2 treatment on the growth and protein expression of Nicotiana benthamiana，the seedlings were treated with CdCl2. The growth status of the seedlings was observed and the length of the root and stem was recorded. The protein of Nicotiana benthamiana were extracted by SDS extraction，and isolated by SDS-PAGE. A large number of experimental data showed that low concentration of CdCl2 could promote the growth of the seedlings，while the high concentration of CdCl2 inhibited the growth of the seedlings. When the concentration of CdCl2 reached 0.5 mmol/L，the growth of seedlings began to be inhibited. If the concentration of CdCl2 was greater than 1.5 mmol/L，the seedlings turned yellow and withered. SDS-PAGE showed that low concentration of CdCl2 could increase the total protein content of the plant，but with the increase of CdCl2 concentration，the total protein content of Nicotiana benthamiana significantly decreased.

Key words： CdCl2; Nicotiana benthamiana; seedling; total protein; SDS-PAGE

伴隨著經(jīng)濟發(fā)展，重金屬對土壤的污染日益嚴重，已成為亟待解決的世界性難題。重金屬元素鎘（Cd）對生物體具有較強毒性，遷移性強且易積累[1，2]。Cd在土壤中主要是以化合物氯化鎘（CdCl2）的形式存在，當濃度超過一定值時，生物體的生長受到抑制，表現(xiàn)出了一系列的CdCl2毒害效應[3，4]。土壤Cd污染對植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、細胞結(jié)構(gòu)以及植物體壽命有著重要的影響[5，6]。Cd能阻礙植物體葉綠素合成，影響植物對CO2的吸收和O2的排放能力，使其生物合成代謝能力下降[7-9]。當土壤中Cd的含量不斷升高時，植物氣孔的開放受到抑制，從而影響植物的蒸騰作用以及光合作用，造成植物體內(nèi)的營養(yǎng)成分失調(diào)[10，11]。此外，Cd還可使植物中某些酶的活性喪失，破壞生物膜結(jié)構(gòu)或引起細胞的氧化應激，導致活性氧自由基（ROS）增加，攻擊生物體中細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)[12-15]。Cd在生物體中不易分解和轉(zhuǎn)化，是一種極具危害性的土壤污染重金屬，能夠通過食物鏈逐級往上傳遞，并不斷富集[5，10，11]。Cd可在人體內(nèi)積累，對神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)等造成嚴重的傷害，具有極強的致癌、致畸作用，嚴重危害人類的健康[14]。近年來，重金屬Cd污染的治理已成為國內(nèi)外學者研究的熱點問題。土壤中的Cd主要是以Cd2+和螯合物的形式進入植物根系細胞，利用H+/陽離子反向運輸器、P1B-ATP酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等轉(zhuǎn)運到液泡中，經(jīng)共質(zhì)體運輸進入根莖中的木質(zhì)層、韌皮層以及中柱內(nèi)，通過蒸騰作用將其運輸?shù)街参矬w其他的組織內(nèi)[16-18]。

目前，有關(guān)重金屬Cd對植物體的毒害機制尚不十分清楚。為此，本試驗以模式植物本生煙草（Nicotiana benthamiana）為材料，采用不同濃度的CdCl2處理其幼苗，通過分析幼苗生長及蛋白質(zhì)表達情況，研究CdCl2對植物體的毒害效應，以期為今后揭示相關(guān)的生理機制提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本生煙草種子，由山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。

1.2? 方法

1.2.1? 本生煙草種子的消毒及培養(yǎng)? 取本生煙草種子，用0.1%的升汞消毒10 min，無菌水洗滌3～4次，接種于MS基本培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本生煙草的生長條件為16 h光照/8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照度為2 000 lx。

1.2.2? 本生煙草幼苗的CdCl2處理? 取培養(yǎng)10 d的本生煙草幼苗，轉(zhuǎn)接到含不同濃度CdCl2（0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mmol/L）的MS基本培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中進行垂直培養(yǎng)。

1.2.3? 本生煙草幼苗根長和莖長的測量? 每天觀察幼苗生長狀況，測量并記錄本生煙草幼苗在不同濃度CdCl2處理時根和莖的長度，連續(xù)統(tǒng)計14 d。試驗3次重復。

1.2.4? 提取本生煙草幼苗的總蛋白質(zhì)? 取本生煙草幼苗，加入1 mL SDS提取液1（5%蔗糖，5% β-巰基乙醇，4% SDS）進行研磨，靜置30 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上清，加入8倍體積的丙酮，? ?-20 ℃靜置1 h以上。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，留沉淀進行干燥。加入50 μL SDS提取液2（5%蔗糖，5% β-巰基乙醇，4% SDS，1% NP-40）重懸沉淀，煮沸3 min。4 ℃，12 000 r/min離心5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5? SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)? 制備分離膠（T=10%）和濃縮膠（T=5%）。將蛋白樣品上樣。電泳初始電壓為100 V，樣品進入分離膠時，將電壓調(diào)整為180 V。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍（R-250）染色。加入脫色液進行脫色，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶。觀察并拍照記錄。

1.2.6? 數(shù)據(jù)分析? 采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過配對樣本t檢驗進行顯著性檢測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CdCl2處理對本生煙草幼苗生長狀態(tài)的影響

用不同濃度CdCl2處理本生煙草幼苗7 d后，觀察本生煙草幼苗的生長情況。試驗結(jié)果顯示，與對照組相比（圖1A），當培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125～0.250 mmol/L時，幼苗的生長基本正常（圖1B、圖1C）;當培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.500 mmol/L時，幼苗的生長開始受到抑制，生長速度下降（圖1D）;當CdCl2濃度達到0.750～1.000 mmol/L時，幼苗生長遲緩，出現(xiàn)葉片枯黃或植株枯萎現(xiàn)象（圖1E、圖1F）;當CdCl2濃度超過1.000 mmol/L，葉片枯黃和植株枯萎更為明顯，尤其當CdCl2濃度達到2.000 mmol/L，大部分本生煙草幼苗枯萎死亡，植株生長受到明顯抑制（圖1G、圖1H）。

當CdCl2處理本生煙草幼苗14 d后，0.250 mmol/L CdCl2處理幼苗的對照組（圖1I）和生長情況（圖1K）基本相似;但0.125 mmol/L CdCl2處理的幼苗植株生長要優(yōu)于對照組，表現(xiàn)出一定的促進作用（圖1J）;當培養(yǎng)基中CdCl2濃度達到0.500 mmol/L時，幼苗停止生長，大部分植株葉片枯黃（圖1L）;當培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.750～1.000 mmol/L時，幼苗植株個體小，大部分葉片枯黃和植株枯萎（圖1M、圖1N）;當CdCl2濃度大于1.000 mmol/L時，葉片枯黃和植株枯萎現(xiàn)象更為明顯，隨著CdCl2濃度繼續(xù)增加，本生煙草幼苗全部枯萎死亡（圖1O、圖1P）。

2.2? CdCl2處理對本生煙草幼苗莖和根長度的影響

對CdCl2處理7 d后的本生煙草幼苗的莖長進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖2A所示。當培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125～0.250 mmol/L時，幼苗莖的長度在0.7～1.0 cm，和對照組區(qū)別不大。其中CdCl2濃度為0.125 mmol/L時，莖的生長速度稍快，接近1.0 cm。當CdCl2的濃度大于0.5 mmol/L時，莖的長度明顯遞減，和對照組差異顯著。尤其當CdCl2濃度達到2.000 mmol/L時，和對照組差異極顯著。當CdCl2處理14 d時（圖2B），0、0.125、0.250 mmol/L CdCl2濃度下本生煙草幼苗莖繼續(xù)生長，長度相近，生長速度逐漸變慢;當CdCl2濃度超過0.500 mmol/L時，其莖的伸長基本停滯，長度在0.4～0.6 cm，和對照組之間存在極顯著差異。通過分析試驗數(shù)據(jù)可知，低濃度CdCl2對本生煙草幼苗莖的生長有一定的促進作用，但隨著CdCl2濃度的不斷增加，莖的長度越來越短，生長受到了明顯的抑制。

對CdCl2處理7 d后的本生煙草幼苗的根長進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖2C所示。0.125 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗主根的長度最長，接近1.2 cm，生長速度最快;0.250 mmol/L濃度下的本生煙草幼苗的主根長度和對照組相似，長度在0.9～1.0 cm;當CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時，其主根長度明顯變短，和對照組之間存在極顯著的差異。當CdCl2處理14 d時（圖2D），在0、0.125、0.250 mmol/L CdCl2濃度下，本生煙草幼苗根系繼續(xù)生長。其中，當培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125 mmol/L時，幼苗主根生長速度較快，長度接近2.5 cm，和對照組之間差異極顯著。當CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時，其根系的生長已基本停滯，長度在0.4～0.6 cm，和對照組之間差異極顯著。上述結(jié)果表明，低濃度CdCl2可促進本生煙草幼苗根的生長，伴隨著CdCl2濃度的不斷增加，幼苗主根的長度越來越短，生長受到了抑制。

2.3? CdCl2處理對本生煙草幼苗蛋白質(zhì)含量的影響

不同濃度CdCl2處理本生煙草幼苗7 d和14 d后，利用SDS法提取幼苗植株總蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，分析蛋白質(zhì)含量的變化，結(jié)果如圖3所示。當CdCl2處理本生煙草幼苗7 d時，與對照組相比，0.125～0.500 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗其蛋白質(zhì)合成基本正常;當CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時，蛋白質(zhì)合成受到明顯抑制，含量有所降低。當CdCl2處理本生煙草幼苗14 d后，與對照組相比，0.125 mmol/L CdCl2處理下的幼苗其蛋白質(zhì)含量變化不明顯;0.250～0.500 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗蛋白質(zhì)含量明顯降低;CdCl2濃度超過0.500 mmol/L時，蛋白質(zhì)含量繼續(xù)減少，本生煙草幼苗蛋白質(zhì)合成受到顯著抑制。

3? 小結(jié)與討論

土壤中的多種重金屬對于植物體具有毒害效應。CdCl2作為鎘的化合物存在于自然界中，危害著植物的生長，是一種土壤中比較常見的重金屬污染物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生態(tài)平衡造成了不可估計的損失和影響[19，20]。為了研究CdCl2對植物生長發(fā)育的影響，試驗中，利用不同濃度的CdCl2處理本生煙草幼苗，以觀察統(tǒng)計其根、莖的生長狀況，并檢測蛋白質(zhì)含量的變化。結(jié)果顯示低濃度的CdCl2對本生煙草幼苗的生長有促進作用，而高濃度的CdCl2則抑制其生長。當CdCl2處理本生煙草幼苗7 d時，對照組和低濃度（0.125～0.250 mmol/L）CdCl2處理的幼苗生長狀態(tài)沒有明顯區(qū)別;但高濃度（0.500～2.000 mmol/L）CdCl2處理的幼苗生長比較緩慢，植株矮小甚至出現(xiàn)了葉片枯黃的現(xiàn)象，和對照組差異比較明顯，尤其當CdCl2濃度大于0.750 mmol/L時，幼苗的生長受到了極大抑制，隨著CdCl2處理時間的延長，抑制作用愈發(fā)明顯。當CdCl2處理本生煙草幼苗14 d時，隨著CdCl2濃度（0.500～2.000 mmol/L）的增加，葉片枯黃和植株枯萎的幼苗數(shù)量不斷增加，存活率降低，CdCl2對本生煙草幼苗的毒害效應愈加明顯，其抑制作用愈加顯著。而低濃度（0.125～0.250 mmol/L）CdCl2處理的本生煙草幼苗則繼續(xù)生長，尤其是在0.125 mmol/L的濃度下其根系生長較快，長度最長，表明低濃度CdCl2對本生煙草生長具有明顯的促進效應。

通過SDS-PAGE分離不同濃度CdCl2處理時本生煙草幼苗蛋白質(zhì)并分析其含量變化，試驗數(shù)據(jù)顯示，隨著CdCl2濃度的升高，其蛋白質(zhì)條帶數(shù)目由多到少，顏色也由深變淺。而CdCl2處理幼苗時間不同，其蛋白質(zhì)合成以及含量也不同。隨著CdCl2處理時間的延長，蛋白質(zhì)條帶數(shù)目由多到少，顏色也由深變淺。但0.125 mmol/L CdCl2處理的幼苗其蛋白質(zhì)含量和對照組沒有明顯區(qū)別。SDS-PAGE結(jié)果進一步證實，不同處理時間、不同濃度CdCl2對本生煙草幼苗生長發(fā)育有著不同的毒害效應。試驗初步分析了CdCl2處理對本生煙草幼苗生長及蛋白質(zhì)表達水平影響，研究結(jié)果可以為今后揭示鎘脅迫的生理機制以及污染土壤的植物修復提供參考。

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