周建華 朱志賢 李勇 莫榮利 于翠 胡興明 鄧文

摘要：為明確引起桑椹腐爛病的病原菌種類，2017年從湖北省采集病果，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離，用分離純化的菌株進(jìn)行菌絲塊針刺和孢子液注射接種健康果均可致病，形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)其形態(tài)學(xué)特征與灰霉菌（Botrytis cinerea）一致。在 GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，該菌株的rDNA-ITS序列與Botrytis cinerea和Botrytis fabae相似率最高為99%，用區(qū)分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，進(jìn)一步表明該菌為Botrytis cinerea。致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，引起湖北省桑椹腐爛病的病原菌為Botrytis cinerea。

關(guān)鍵詞：桑椹腐爛病;致病性測(cè)定;形態(tài)學(xué)鑒定;系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)：S663.9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0069-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.016? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Identification of Fruit Rot Pathogen on Mulberry in Hubei Province

ZHOU Jian-huaa，ZHU Zhi-xianb，LI Yongb，MO Rong-lib，YU Cuib，HU Xing-mingb，DENG Wenb

（a.Industry Department/Hubei Sericulture Engineering Technology Research Center;

b.Institute of Economic Crops，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to understand pathogens associate with mulberry rot disease，fruit with rot symptoms were collected from Hubei province in 2017，and the conventional tissue separation method was used to obtain the isolates. Healthy fruits inoculated with purified strain by mycelium plugs puncture and conidia injection both can cause diseased symptoms. Morphological identification showed that the morphological features of the strain were similar to Botrytis cinerea. The Blast search of rDNA ITS sequence of the strain showed 99% sequence identity with Botrytis cinerea and Botrytis fabae in GenBank. The specific primers were used for distinguish Botrytis cinerea and Botrytis fabae，and the construction of molecular phylogenetic tree further confirm the strain was Botrytis cinerea. The results of pathogenicity test，morphological and molecular identification indicated that the pathogen of mulberry rot in Hubei province was Botrytis cinerea.

Key words： mulberry rot;pathogenicity test;morphological identification;phylogenetic tree

桑樹是多年生經(jīng)濟(jì)植物，在亞洲、歐洲、美洲和非洲廣泛種植，過(guò)去被用于絲綢產(chǎn)業(yè)，但近10多年來(lái)，隨著桑椹食品與保健品加工技術(shù)、生產(chǎn)工藝的發(fā)展，以及桑椹采摘游的興起，以生產(chǎn)桑椹為主要目的的果桑產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，全國(guó)果桑種植面積也不斷增加，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)全國(guó)的果桑種植面積達(dá)5.33萬(wàn)hm2，桑果產(chǎn)量近80萬(wàn)t[1]。隨著種植面積的擴(kuò)大，病害問(wèn)題日益突出，極大地影響了桑椹的產(chǎn)量和品質(zhì)。

湖北省是全國(guó)農(nóng)業(yè)區(qū)劃確定的桑蠶最適宜區(qū)域，有4 000多年栽桑養(yǎng)蠶的歷史，是全國(guó)蠶桑十大省份之一[2]，武漢市、赤壁市、黃岡市、英山縣、洪湖市、宜都市等地都建立了果?；?，果桑規(guī)模逐年擴(kuò)大。在2017年調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，除桑椹菌核病外，桑椹果肉腐爛病發(fā)生普遍，發(fā)病率5%～20%，病椹初期出現(xiàn)淺褐色病斑，病斑擴(kuò)展后呈現(xiàn)深褐色水漬狀，桑椹小漿果逐漸腐爛，最后整個(gè)病椹脫落。為了明確該病的病原，本研究對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定和致病性測(cè)定，以期為病害防治提供理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? 病原菌的分離與保存

2017年從湖北省采集發(fā)病病果，將發(fā)病小核果在75%乙醇中浸泡30 s，在4%次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，然后用滅菌水漂洗3次，將小核果置于PDA平板上（2%葡萄糖、1.5%瓊脂粉，每升培養(yǎng)基加20滴25%的乳酸），于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。然后將分離物轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA平板純化，將純化的菌株用濾紙片保存于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 菌株致病性測(cè)定

菌絲塊致病性測(cè)定。將分離純化的菌株在PDA平板上25 ℃條件下暗培養(yǎng)10 d。用直徑6 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌絲塊，用無(wú)菌注射器針刺花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），將菌絲塊置于針刺部位。然后置于鋪有3層滅菌吸水紙的9 cm玻璃皿中，25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，每隔1 d觀察1次發(fā)病情況，以針刺接種PDA培養(yǎng)基的桑椹為試驗(yàn)對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)3顆桑椹。待桑椹顯現(xiàn)出明顯的癥狀后進(jìn)行再分離，觀察再分離的菌株與原接種菌株在相同培養(yǎng)條件下的形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

分生孢子液致病性測(cè)定。將分離純化的菌株在PDA平板上25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)10 d。用無(wú)菌水清洗菌落，4層擦鏡紙過(guò)濾分生孢子，8 000 r/min離心5 min，去上清液，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)整成1×105個(gè)/mL。用無(wú)菌注射器吸取100 μL分生孢子懸浮液注射接種花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），以接種無(wú)菌水的桑椹為試驗(yàn)對(duì)照，后續(xù)操作步驟同菌絲塊致病性測(cè)定。

1.3? 形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的代表菌株接種于PDA平板上進(jìn)行活化，置于25 ℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)3 d后，用直徑6 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌絲塊，將其轉(zhuǎn)至新的PDA平板上，25 ℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，設(shè)5次重復(fù)，分別于3、5 d測(cè)量菌落直徑。根據(jù)菌落直徑計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，計(jì)算公式：菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）=（5 d菌落直徑-3 d菌落直徑）/2。觀察菌株形態(tài)、色澤以及是否產(chǎn)生孢子和菌核，在光學(xué)顯微鏡下（Leica，DM500）觀察分生孢子形狀，并測(cè)量其大小。

1.4? 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1? 基因組DNA提取? 將菌株轉(zhuǎn)入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央培養(yǎng)，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后收集菌絲。采用CTAB法提取病菌基因組DNA[3]，具體步驟如下：①將供試菌株轉(zhuǎn)入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央，25 ℃培養(yǎng)5 d后刮取菌絲。將菌絲在液氨中研磨成粉末狀，放入1.5 mL EP管中，往EP管中加入65 ℃預(yù)熱好的CTAB提取緩沖液（2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl）600 μL，混勻后置于水浴鍋65 ℃水浴30 min，中間混勻1～2次;②加入600 μL氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min離心10 min;取上清液，重復(fù)1次;③2次沉淀后取上清液，加入無(wú)水乙醇1.2 mL，在-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min;④沉淀用70%乙醇洗2遍，37 ℃風(fēng)干1 h，溶于50 μL去離子水中，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2? rDNA-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增? 利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物對(duì)ITS1（5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC

-3′）作為序列擴(kuò)增和測(cè)序引物[4]，引物均由擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)為總體積50 μL體系，包括2×Es Taq Mastermix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 50 ng 1 μL，加入ddH2O至體系體積達(dá)50 μL。將配好的PCR體系在Ti-PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司，S1000TMThermal Cycler）上進(jìn)行擴(kuò)增。ITS 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與2 μL 6×loading buffer混合（含1‰SYBR GreenI核酸染料，北京百泰克生物技術(shù)有限公司），經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像（美國(guó)Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+）下檢查擴(kuò)增結(jié)果，并委托擎科生物科技有限公司進(jìn)行DNA純化和測(cè)序。

1.4.3? 特異性引物檢測(cè)? 用區(qū)分灰霉菌（Botrytis cinerea）和蠶豆葡萄孢（Botrytis fabae）PCR引物（C729+/-：AGCTCGAGAGAGATCTCTGA/CTGCAA TGTTCTGCGTGGAA）[5，6]來(lái)對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定的菌株進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增體系同ITS擴(kuò)增體系，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.4.4? 系統(tǒng)發(fā)育分析? 將供試菌株ITS測(cè)序結(jié)果在DNAMAN軟件（Version 5.2.2）中校對(duì)拼接后，將測(cè)序的DNA序列提交給GenBank，獲得登錄號(hào)。將DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中的序列進(jìn)行比對(duì)，選取與其同源性高的序列，采用CLUSTALX（Version 1.83）對(duì)序列片段進(jìn)行比對(duì)（alignment）[7]，設(shè)定參數(shù)。多重序列比對(duì)參數(shù)：起始空位罰分（gap opening）=10，延伸空位罰分（extension opening）=0.2，轉(zhuǎn)移權(quán)系數(shù)（transition weight）=0.5，延遲發(fā)散序列（delay divergent sequences）=30%。根據(jù)需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行校對(duì)[8]。比對(duì)后采用MEGA 5.05軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用Kimura 2 parameter（K2P） substitution模型，進(jìn)化樹用自展分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，循環(huán)1 000次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌分離、純化和保存

2017年從湖北省發(fā)生危害嚴(yán)重的果?；夭杉?0份桑椹腐爛病樣品（圖1），采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離，均能分離出灰霉屬真菌且形態(tài)相似。將分離的菌株移至新鮮的PDA平板純化，用濾紙片法保存于-20 ℃冰箱。以Bg2為代表菌株進(jìn)行鑒定，本研究中涉及到病原菌的所有試驗(yàn)，均使用該菌株。

2.2? 致病性測(cè)定

菌絲塊和分生孢子液致病性測(cè)定結(jié)果表明，2種接種方法均可引起桑椹腐爛病發(fā)生，接種第3 d可觀察到病斑，小核果病斑初期為淺褐色，后期為水漬狀深褐色。分生孢子液接種比菌絲塊接種發(fā)病快，第5天時(shí)，菌絲塊接種的桑果僅少數(shù)小核果變褐腐爛（圖2A），而分生孢子液接種的桑椹整顆腐爛，花梗也全部腐爛，在病椹周圍形成白色霉層（圖2B）。

2.3? 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

Bg2菌株在PDA上菌落呈放射狀，中等氣生菌絲，4～5 d后菌落四周產(chǎn)生大量分生孢子，呈深灰褐色（圖3A、B、C）;后期產(chǎn)生大量微菌核。菌核黑色，圓形、球形或不規(guī)則的形狀（1.0～5.8） mm×（1.0～4.0） mm。分生孢子聚生于膨大的產(chǎn)孢細(xì)胞上（圖3D），無(wú)隔膜，橢圓形或卵圓形，（3～11.8） μm×（2.2～6.8） μm。培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與參考文獻(xiàn)[9]比對(duì)，將病原菌鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers. ex Fr.）。

2.4? 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1? ITS 區(qū)序列分析? 使用真菌ITS區(qū)域的引物ITS1和ITS4，對(duì)病原菌Bg2進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為521 bp的片段，將測(cè)序的DNA序列上傳到GenBank上（MF445059），測(cè)序結(jié)果與GenBank NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性達(dá)99%。

2.4.2? 特異性引物檢測(cè)? 用區(qū)分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性PCR引物（C729+/-）對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定為Botrytis cinerea的菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的700 bp條帶，陰性對(duì)照不擴(kuò)增（圖4）。

2.4.3? 系統(tǒng)發(fā)育分析? 在數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與Botrytis cinerea（MF445059）相近的代表性菌株序列用Clustal X（Version 1.83）進(jìn)行多序列比對(duì)，用 MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明該菌株與Botrytis cinerea聚為一類（圖5）。

3? 討論

根據(jù)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征、分子生物學(xué)分析結(jié)果，將引起桑椹腐爛病的病原菌鑒定為Botrytis cinerea?；颐共【闹鲝V泛，可危害400多種植物[9]，Martinez等[10]報(bào)道灰霉病菌種內(nèi)培養(yǎng)形狀變異較大，具有豐富的多樣性。張靜[11]對(duì)湖北省灰霉病病菌區(qū)系和灰葡萄孢菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)或者同一地區(qū)不同的分離物，不同寄主或者同一寄主的不同部位所獲得的灰霉菌菌株的形態(tài)存在很大差異。桑椹腐爛病菌是否存在形態(tài)學(xué)差異及遺傳變異還需多收集更多病樣材料進(jìn)行分離鑒定。

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，將桑椹腐爛病菌ITS測(cè)序結(jié)果與GenBank NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性達(dá)99%。Botrytis cinerea和Botrytis fabae形態(tài)學(xué)差異小，主要區(qū)別是菌核及分生孢子大小[5，12]，同時(shí)由于灰霉病菌形態(tài)學(xué)特征受環(huán)境和培養(yǎng)條件的影響，所以本研究采用區(qū)分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性引物（C729+/-）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，該引物擴(kuò)增Botrytis cinerea產(chǎn)生700 bp大小的條帶，而擴(kuò)增Botrytis fabae會(huì)產(chǎn)生600 bp的條帶[6]。用該引物對(duì)桑椹腐爛病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)構(gòu)建ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分子驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該引物只擴(kuò)增出700 bp的條帶，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹與Botrytis cinerea聚為一類，分子生物學(xué)鑒定進(jìn)一步說(shuō)明桑椹腐爛病菌為Botrytis cinerea。

雖然在《臺(tái)灣產(chǎn)菌類調(diào)查報(bào)告》的灰霉菌（Botrytis cinerea） 寄主目錄中曾提到該病菌寄生于桑樹，也有報(bào)道桑樹灰霉病會(huì)造成桑樹葉部病害[13];王澤林等[14]報(bào)道?；颐共≈饕植加谒拇ā⒄憬刃Q區(qū)，以四川蠶區(qū)發(fā)病較重。該病主要在春季發(fā)生，為害桑樹的新梢、葉片、雄花和桑椹，對(duì)桑葉產(chǎn)質(zhì)量的影響較大;韓蓓蓓[15]從采后腐爛桑椹上分離真菌獲得葡萄孢屬（Botrytis spp.）霉菌;但是本研究首次分離鑒定了引起桑椹生長(zhǎng)期腐爛病的病原菌為Botrytis cinerea。

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