張麗麗+李潔+陳長(zhǎng)寶+朱樹(shù)華+周杰+尚鵬鵬 ??

摘要以合成的烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮為功能單體，三聚氰胺為模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，在表面等離子體共振（SPR）傳感芯片上合成了分子印跡聚合物薄膜。根據(jù)印跡聚合物的朗格繆爾方程式，計(jì)算得到三聚氰胺和分子印跡聚合物之間的結(jié)合常數(shù)為140×108 L/mol。此傳感器顯示出對(duì)模板分子三聚氰胺的高選擇性，在pH=75的條件下，此傳感器對(duì)三聚氰胺的響應(yīng)最佳，線性范圍為01

Symbolm@@ 100 nmol/L（R=09991）。將此傳感器用于牛奶和奶粉中三聚氰胺的檢測(cè)，檢出限分別為626 pmol/L和564 pmol/L（S/N=3），回收率分別為915%和920%。

關(guān)鍵詞三聚氰胺；分子印跡；表面等離子體共振傳感器

1引 言

三聚氰胺（Melamine，MM）是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，可用于生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹(shù)脂，被廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、木材加工、造紙、皮革以及電氣等行業(yè)。MM分子中含氮量達(dá)到667%，因而會(huì)被不法商家用于食品和飼料中，以提高產(chǎn)品中的氮含量。美國(guó)食物及藥物管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，MM每日最大攝入量為063 mg/（kg·bw）[1]。國(guó)家衛(wèi)生部2011年第10號(hào)公告“關(guān)于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011年 第10號(hào)）”中規(guī)定，嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，其它食品中三聚氰胺的限量值為25 mg/kg[2]。長(zhǎng)期攝入MM會(huì)導(dǎo)致腎結(jié)石，甚至誘發(fā)膀胱癌或腎衰竭[3，4]。因此，食品中MM的檢測(cè)引起了極大的關(guān)注。目前檢測(cè)MM的方法有高效液相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜質(zhì)譜法[5， 6]、比色法[7，8]、酶聯(lián)免疫法[9，10]、表面增強(qiáng)拉曼法[11，12]等。但因?yàn)槭称坊|(zhì)復(fù)雜，且MM在食品中含量低，所以大多數(shù)方法的前處理過(guò)程比較繁瑣，常需進(jìn)行樣品富集，耗時(shí)費(fèi)力。因此，發(fā)展前處理簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高的檢測(cè)方法很有必要。

近年來(lái)，表面等離子體共振技術(shù)（SPR）由于具有簡(jiǎn)易、快速、無(wú)標(biāo)記及靈敏度高等特性而備受關(guān)注，SPR傳感器在生命科學(xué)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[13～16]。然而SPR傳感器常需要采用昂貴且不穩(wěn)定的配體分子如抗原或受體， 識(shí)別目標(biāo)分子，這一不足可通過(guò)設(shè)計(jì)一些耗費(fèi)低且具有穩(wěn)定的識(shí)別位點(diǎn)的探針等方法克服[17]。分子印跡技術(shù)能提供特異性結(jié)合位點(diǎn)[18]，而且印跡聚合物具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性，成本低，制備簡(jiǎn)單，可循環(huán)利用[19]。因此，結(jié)合SPR和分子印跡技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可有效提高目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度和選擇性。本課題組在前期工作中制備了系列SPR印跡傳感器，并成功用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)物的檢測(cè)[17，20～23]。其中，以4乙烯基吡啶為功能單體制備了雙酚A傳感器，建立了雙酚A的檢測(cè)方法[17]；以甲基丙烯酸為功能單體制備了3，3二氯聯(lián)苯胺傳感器，將其用于自來(lái)水和土壤樣品中3，3二氯聯(lián)苯胺的檢測(cè)[22]。

根據(jù)三聚氰胺分子特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)合成了一種能與MM通過(guò)氫鍵有效結(jié)合的功能單體烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮。利用分子印跡技術(shù)，在SPR傳感芯片上修飾三聚氰胺分子印跡聚合物，建立了檢測(cè)MM的SPR分析方法，對(duì)于環(huán)境和食品樣品中MM的檢測(cè)和分離具有重要意義。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

FTSPR 100型表面等離子體共振儀、傳感金片（18 cm×18 cm）（美國(guó)Thermo公司）； Mercury Plus400型核磁共振儀（美國(guó)Varian公司）。

乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、苯代三聚氰胺、碳酸二乙酯（分析純，Aldrich公司）； 偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化工有限公司）； 烯丙硫醇（70%，上海市晶純?cè)噭┯邢薰荆?MM（化學(xué)純，上海試劑一廠）； 三聚氰酸（化學(xué)純）、縮二脲（分析純）（Aladdin公司）； 二甲亞砜（DMSO，分析純，天津市巴斯夫化工有限公司）； 丙烯胺（分析純，成都貝斯特試劑有限公司）； 乙腈（色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所有溶液在進(jìn)行SPR實(shí)驗(yàn)前，均通過(guò)045 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾。

22實(shí)驗(yàn)方法

221功能單體的合成與表征（1）硝基縮二脲的合成[24]： 將375 mL濃H2SO4和90 mL濃HNO3置于燒杯中，冷卻至0℃。加入150 g縮二脲，冰浴攪拌1 h后，室溫?cái)嚢柚凉腆w全部溶解。加入300 g冰，攪拌至室溫后抽濾。將所得固體溶于水中，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 85，過(guò)濾，用37% HCl調(diào)節(jié)至pH 20，抽濾，真空干燥。得到白色固體產(chǎn)物80 g，產(chǎn)率37%。熔點(diǎn)： 231℃；1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ： 7180 （br d， 2H）， 9334 （br s， 1H）； 13C NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 147765 （CO）， 15301（CO）；IR （KBr） v： 3426， 3290， 2974， 2807， 1736， 1631， 1576， 1489， 1431， 1386， 1335， 1201， 1073， 1015， 957， 758， 598， 503 cm

Symbolm@@ 1。

（2）烯丙基縮二脲的合成[25]： 將80 g硝基縮二脲和480 mL水放入100 mL的圓底燒瓶中，逐滴加入40 mL丙烯胺，攪拌1 h后加熱回流2 h，冷卻至室溫。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得固體用水重結(jié)晶，抽濾，真空干燥。得到白色固體產(chǎn)物177 g，產(chǎn)率23%。熔點(diǎn)： 141～142℃；1H NMR（400 MHz， DMSO） δ： 3778（t， 2H， NCH2）， 506～518（m， 2H， CH2） 579～589（m， 1H， CH）， 6608（s， 2H， NH2）， 7622（s， 1H， NH）， 8618（s， 1H， NH）；13C NMR（400 MHz， DMSO） δ： 41065（CH2N）， 114760（CH2）， 134684（CH）， 154323 （CO）， 155649 （CO）。endprint

（3）烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮 （Allylcyanurate）的合成[25]： 將0856 g Na加到413 mL無(wú)水乙醇中制得乙醇鈉，再加入177 g烯丙基縮二脲和2921 g碳酸二乙酯， 加熱回流4 h。冷卻至室溫， 抽濾，用乙醇乙醚（1∶1， V/V）溶液洗滌固體，用濃HCl重結(jié)晶，5℃下放置12 h，抽濾，真空干燥。得到白色產(chǎn)物154 g，產(chǎn)率74%。熔點(diǎn)： 211～213℃；1H NMR （400 MHz， DMSO） δ： 4289 （t， 2H， NCH2）， 5115～5199 （m， 2H， CH2）， 5764～5860 （m， 1H， CH）， 11452 （s， 2H， NH）；13C NMR （400 MHz， DMSO） δ： 42123 （CH2N）， 116564 （CH2）， 131773 （CH）， 148221 （CO）， 149167 （CO）；IR （KBr） v： 3442， 3227， 3100， 2955， 1770， 1590， 1460，1398， 943， 760 cm

Symbolm@@ 1。

222三聚氰胺分子印跡SPR傳感器的制備三聚氰胺分子印跡SPR傳感器的制備過(guò)程見(jiàn)圖1。將SPR裸金傳感片放入新配制的Piranha溶液（H2SO4H2O2， 70∶30， V/V）中清洗2 min，用水沖洗芯片，氮?dú)獯蹈珊蠓湃牒?0 mmol/L烯丙硫醇的乙醇溶液中，4℃放置過(guò)夜。用乙醇、水反復(fù)沖洗，氮?dú)獯蹈?。稱取2090 mg功能單體和120 mg MM，溶于7 mL DMSO中，靜置2 h使二者形成穩(wěn)定的復(fù)合物。然后加入590 mg AIBN和1577 mg EGDMA，將上述傳感金片放入其中，密封，通氮?dú)獬?5 min，60℃引發(fā)聚合，反應(yīng)24 h。取出金片，用甲醇和水清洗芯片表面，再將其放入2%乙酸和18%甲醇溶液中，除去模板分子和未反應(yīng)的化合物。用無(wú)水乙醇和水清洗金片，氮?dú)獯蹈?。非印跡聚合物芯片制備方法除不加MM外，其它步驟與上述方法相同。

223實(shí)際樣品的制備奶粉樣品提?。?取50000 g奶粉，加入15 mL甲醇，室溫下超聲提取15 min。10000 r/min離心3 min，上清液減壓蒸干，溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=75）中。

液態(tài)牛奶樣品提取： 取500 mL純牛奶置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩1 min后以10000 r/min離心3 min，上清液減壓蒸干，溶于50 mL PBS（pH=75）中。

Symbolm@@ 1左右，此時(shí)入射角有最小的反射率?？刂茖?shí)驗(yàn)溫度為25℃，流動(dòng)緩沖溶液為PBS （02 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH=75）?？紤]識(shí)別位點(diǎn)與三聚氰胺的氫鍵結(jié)合作用，選擇2%乙酸和18%甲醇溶液為再生液。每次測(cè)試前，SPR傳感金片用再生液以流速286 mL/min沖洗，波數(shù)迅速下降，穩(wěn)定后用PBS沖洗直至得到穩(wěn)定的SPR基線。將不同濃度的被檢測(cè)物溶解于流動(dòng)緩沖液中，以流速0225 mL/min進(jìn)入到流動(dòng)池中，直到波數(shù)變化達(dá)到穩(wěn)定值，通過(guò)FTSPR實(shí)時(shí)記錄波數(shù)變化（圖2）。

3結(jié)果與討論

31三聚氰胺分子印跡膜厚度的計(jì)算

傳感片的鍍金薄膜首先通過(guò)AuS 鍵連接上雙功能分子烯丙硫醇，再通過(guò)烯丙硫醇的雙鍵與功能分子中烯丙基端的作用連接上分子印跡聚合物涂層。圖3是裸金片和修飾上印跡聚合物（MIP）及非印跡聚合物（NIP）后的金片在磷酸鹽緩沖液中的SPR譜圖。與裸金片相比，MIP和NIP金片的波數(shù)分別紅移了31347和18336 cm

Symbolm@@ 1，表明在傳感器表面形成了一定厚度的印跡和非印跡聚合物。根據(jù)文獻(xiàn)[26]計(jì)算厚度的方法，MIP和NIP金片的膜厚度分別約為78和46 nm。

32pH值對(duì)吸附性能的影響

印跡聚合物對(duì)MM的識(shí)別作用主要靠識(shí)別位點(diǎn)上的羰基和亞氨基與MM分子中的氨基和雜環(huán)氮之間的互補(bǔ)氫鍵作用，pH值可能影響印跡聚合物對(duì)MM的識(shí)別靈敏度?？紤]到兩者之間的氫鍵作用及三聚氰胺是弱堿性化合物，測(cè)定了pH 65～85范圍內(nèi)三聚氰胺分子印跡傳感器對(duì)90 nmol/L MM的響應(yīng)。如圖4所示，pH=75時(shí)，波數(shù)位移最大，說(shuō)明此pH值下與印跡聚合物中識(shí)別位點(diǎn)的氫鍵作用最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇pH=75。

33三聚氰胺分子印跡聚合物的吸附性

為評(píng)價(jià)三聚氰胺分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)分子的吸附能力，在最佳pH值條件下測(cè)定了MIP和NIP傳感芯片的性能。由圖5可見(jiàn)，MM濃度在01 nmol/L～30 μmol/L范圍內(nèi)，波數(shù)位移隨濃度的增大而升高，當(dāng)濃度大于30 μmol/L后，波數(shù)位移不再變化，說(shuō)明此時(shí)吸附達(dá)到飽和。MIP傳感芯片達(dá)到飽和時(shí)的波數(shù)位移為13 cm

Symbolm@@ 1，而NIP芯片達(dá)到飽和時(shí)的波數(shù)位移為26 cm

Symbolm@@ 1。說(shuō)明由于印跡效應(yīng)，MIP芯片對(duì)三聚氰胺的吸附效果更好。如圖5插圖所示，MM濃度在01～100 nmol/L時(shí)，MIP芯片對(duì)MM的波數(shù)響應(yīng)與其濃度呈良好的線性關(guān)系，方程為v（cm

Symbolm@@ 1）=08083+0 4460CMM （nmol/L） （R=09991），檢出限為426 pmol/L（S/N=3）。

其中，v和vsat分別表示波數(shù)變化和吸附MM達(dá)到飽和后的波數(shù)變化，Kass為MM和分子印跡聚合物之間的結(jié)合常數(shù)。根據(jù)圖5結(jié)果，得到印跡聚合物的朗格繆爾方程式為： 1v=01119+7988×10

Symbolm@@ 10[MM]（R=09979）。 由直線方程截距和斜率的比值得到Kass=140×108 L/mol。由ΔG=endprint

Symbolm@@ RTlnKass可得到印跡聚合物和MM之間結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)ΔG=

Symbolm@@ 465 kJ/mol， ΔG<0說(shuō)明印跡聚合物中的結(jié)合位點(diǎn)和MM之間的結(jié)合是自發(fā)過(guò)程。

傳感器經(jīng)2%乙酸和18%甲醇溶液再生后可重復(fù)使用。傳感器對(duì)90 nmol/L MM重復(fù)測(cè)定11次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為21%。表明傳感器具有較好的穩(wěn)定性，且再生效果較好。

34三聚氰胺分子印跡聚合物的選擇性

考察了濃度均為40 nmol/L的MM及其三種結(jié)構(gòu)類似物三聚氰酸（Cyanuric acid）、苯代三聚氰胺（Benzoguanmine）和鳥(niǎo)苷（Guanosine）在分子印跡SPR傳感芯片上的相應(yīng)。由圖6可知，與NIP芯片相比，MIP芯片顯示出對(duì)模板分子的高選擇性，表明印跡過(guò)程中在聚合物的內(nèi)部形成了對(duì)模板分子識(shí)別的特異性結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)大小和功能基位置都與目標(biāo)分子相匹配，而與其它3種化合物不匹配。

35實(shí)際樣品分析

為了檢驗(yàn)建立的三聚氰胺分子印跡SPR測(cè)定方法分析實(shí)際樣品的可行性，向牛奶和奶粉樣品提取液中加入MM標(biāo)準(zhǔn)液，使得MM終濃度為20 nmol/L，進(jìn)行SPR分析。由表1可見(jiàn)，牛奶和奶粉中MM的平均回收率為915%和920%。當(dāng)信噪比為3時(shí)，牛奶和奶粉的檢出限分別為626 pmol/L（79 ng/kg）和564 pmol/L（71 ng/kg），低于國(guó)標(biāo)GB/T 223882008中的最低定量限0005 mg/kg[5]和GB/T 224002008中檢出限005 mg/kg[6]，以及衛(wèi)生部公告[2]的限量值。

4結(jié) 論

以合成的烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮作為功能單體，MM為模板分子，制備了三聚氰胺分子印跡SPR傳感器，用于牛奶和奶粉樣品中MM的檢測(cè)，檢出限分別為626 pmol/L和564 pmol/L。 與國(guó)標(biāo)方法相比，本方法具有較高的選擇性和靈敏度，可用于復(fù)雜樣品中MM的分析。

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AbstractThe melamine molecular imprinted polymer （MIP） membrane immobilized on the surface of the surface plasmon resonance （SPR） chip was prepared with allylcyanurate and ethylene glycol dimethacrylate as a functional monomer and crosslinker， respectively Based on the ratio of the intercept to the slope of Langmuir equation for imprinted polymer， the association constant （Kass） of imprinted sites in the imprinted film to melamine was calculated to be 140×108 L/mol The SPR sensor showed high selectivity to the template molecule melamine， and the best response was obtained at pH=75 The method showed good linearity in the melamine concentration range of 01-100 nmol/L （R=09991） Based on a signal to noise ratio of 3， the detection limits of melamine were 626 pmol/L and 564 pmol/L for the milk and milk powder， respectively The recoveries were 915% for milk and 920% for milk powder These results suggest that SPR sensing combined with MIP film is a promising alternative method for detection of melamine

KeywordsMelamine； Molecular imprinting； Surface plasmon resonance sensorendprint