白敏+曹曉文+陳鋒+趙越+趙永席

摘要硫化氫（2S）作為一種重要的氣體信號分子，其細胞水平異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究針對現(xiàn)存熒光探針的胞內(nèi)非特異性響應問題，發(fā)展了一種基于量子點甲酚紫的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（rster resonance energy transfer，RE）探針，利用比率熒光分析，實現(xiàn)活細胞內(nèi)2S的靈敏成像。通過一步超聲乳化法制備量子點納米球，再結(jié)合疊氮甲酚紫（CVN3）制得無機有機雜化QDSN3比率探針。此納米探針尺寸均一，粒徑約為120 nm，酸性穩(wěn)定性高，且無細胞毒性。2S可將CVN3上的N3還原成N2，生成的氨基甲酚紫（CVN2）作為RE受體，吸收量子點納米球的橙色熒光，產(chǎn)生紅光信號。通過兩個波長的熒光強度的比率分析可有效消除光源強度波動和細胞內(nèi)復雜環(huán)境等的干擾，最終實現(xiàn)了活細胞內(nèi)2S成像。

關鍵詞量子點； 甲酚紫； 比率熒光； 細胞成像； 硫化氫

1引 言

硫化氫（2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后，被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子[1～]。大量研究證實，其細胞水平異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5～12]。因此，監(jiān)測生物體內(nèi)2S濃度，對于深刻理解生命過程和疾病機制都具有重要的研究意義。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種2S檢測方法，如氣相色譜法[13]、電化學分析法[1]、比色法[15]和紫外吸收法[16]等。然而這些方法通常需要破壞樣本才可檢測。相比之下，熒光檢測具有時間和空間取樣能力及高靈敏度的特性，適用于原位和非侵入性分析[17，18]。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了很多具有優(yōu)異性能的熒光2S探針，其中大部分優(yōu)先使用熒光Offon策略，實現(xiàn)敏感檢測[19～22]。然而，熒光Offon反應容易受探針濃度、細胞內(nèi)復雜環(huán)境、激發(fā)強度等的影響，導致數(shù)據(jù)失真[23]。相比之下，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移（rster resonance energy transfer，RE）兩個波長的熒光強度的比率測量可以有效解決這些問題。

近年出現(xiàn)的量子點新技術開辟了分子成像和熒光分析檢測的新領域。量子點是由有限數(shù)目的原子組成，其3個維度的尺寸均在納米數(shù)量級，是一種理想的新型熒光探針。相比于有機熒光分子及熒光蛋白等熒光標簽，量子點具有以下優(yōu)點[2～26]：色彩豐富、量子產(chǎn)率高且光化學穩(wěn)定性好； 激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，其發(fā)射光譜波長范圍狹窄且對稱、具有很好的單色性且發(fā)射顏色易于調(diào)控； 能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射，有持久的穩(wěn)定性，且光不易被漂白； 尺寸小，空間位阻小，可進行單分子標記； 易于表面功能化修飾，從而可應用于生物體內(nèi)物質(zhì)檢測。量子點的合成和應用研究在熒光分析檢測、活體成像、基因運輸、癌癥診斷和治療等方面都得到了很大的發(fā)展[27～30]。將量子點與甲酚紫染料結(jié)合，制備RE比率探針，用于胞內(nèi)活性物質(zhì)的分析檢測還未見相關報道?；诖耍狙芯繕嫿嘶诹孔狱c甲酚紫的RE比率探針，此探針合成方法簡單、快速，得到的納米球尺寸均一，粒徑約為120 nm，通過M分析證明此探針無細胞毒性，最終實現(xiàn)了活細胞內(nèi)2S成像。

2實驗部分

21儀器與試劑

7700透射電鏡（日本日立公司）； Y92Ⅱ超聲波細胞粉碎機（中國寧波新芝生物科技股份有限公司）； luoroMax熒光分光光度計（法國oriba obin Yvon公司）； NanoS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）； 50ELISA酶標儀（瑞士帝肯公司）； iE倒置顯微鏡（日本尼康公司）。

苯乙烯（≥ 995%）、油酸（分析純）、甲基丙烯酸（≥ 980%）、nCl2（≥ 980%）、 四水合氯化錳（≥ 990%）、 Na2S（≥ 980%）、 偶氮二異丁腈（≥ 980%）、 NaO（≥ 960%）、 NaNO2（≥ 980%）； 疊氮化鈉（分析純）、 Cl（360%～380%）、 甲醇（≥997%）、 三氯甲烷（≥ 990%），以上試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。甲酚紫（染料含量： ～70%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）； 實驗用水為超純水（美國默克密理博公司，電阻率> 182 MΩ cm）。

22實驗方法

221CVN3的制備在0～5℃冰浴條件下， 將NaNO2溶液（10 mmol）加入甲酚紫溶液（10 mmol，溶于2 mol/L Cl）中，均勻攪拌20 min后，緩慢加入NaN3（20 mmol），隨后在室溫下攪拌2 h，得到棕色沉淀，過濾，乙腈重結(jié)晶，干燥，最終得到CVN3棕色固體，保存?zhèn)溆谩?/p>

222量子點納米球的制備首先，根據(jù)前期工作[31]制備得到油相量子點； 其次，制備兩親性高分子[32]：在50 mL反應釜中加入35 mL三氯甲烷，分別加入006 g甲基丙烯酸、50 g苯乙烯、0096 g偶氮二異丁腈，攪拌混合均勻，100℃反應10 h后冷卻至室溫。用甲醇洗滌2遍，離心收集固體，70℃干燥3 h，保存?zhèn)溆茫?最后，稱取50 mg兩親性高分子、15 mg量子點，超聲完全溶解于1 mL三氯甲烷，將該油相混合溶液轉(zhuǎn)至10 mL NaO溶液（p=10）中，超聲乳化得到乳濁液，水浴加熱攪拌，直至三氯甲烷完全揮發(fā)，制得量子點納米球，離心、沉淀再分散于6 mL超純水，最終濃度為19 mg/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

223QDSN3比率熒光探針的制備將正電性CVN3溶液（1 mmol/L）與負電性量子點納米球均勻混合，室溫攪拌過夜。10000 r/min離心3次，沉淀再分散，最終得到QDSN3比率熒光探針。

22細胞毒性分析向96孔板每孔中加入1×105 MC7細胞，培養(yǎng)過夜，加入不同濃度QDSN3比例熒光探針，使最終培養(yǎng)基中QDSN3比率熒光探針的濃度為0～200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h， 通過M毒性實驗分析不同濃度下細胞的生存情況。細胞存活率隨著M甲臜的吸光度（90 nm）的增加而增大。endprint

225基于RE的量子點甲酚紫熒光探針在活細胞內(nèi)對硫化氫成像分別向8孔板每孔中加入×10 MC7、eLa細胞，培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)液，加入含有QDSN3比率熒光探針（0 μg/mL）的無血清DMEM細胞培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)3 h后，加入100 μmol/L Na2S溶液，繼續(xù)培養(yǎng)15 h，用PBS清洗細胞3次，測定細胞成像。

3結(jié)果與討論

31QDSN3比率探針的合成與表征

在芳香重氮鹽中，重氮基上的π電子可與苯環(huán)上的π電子重疊，共軛作用使其穩(wěn)定性增加。因此，芳香重氮鹽可在冰浴溫度下制備和進行反應，可以作為中間體進一步合成疊氮化合物?；诖耍狙芯吭?～5℃下，將氨基甲酚紫（CVN2）上的伯胺與NaNO2作用（在Cl介質(zhì)下），生成中間產(chǎn)物芳香重氮鹽，隨后加疊氮化鈉，疊氮官能團可以很容易地取代重氮基，得到疊氮甲酚紫（CVN3）（圖1A）。通過超聲乳化步驟，油相CCl3溶劑中包含有帶有合適負電的高分子和發(fā)橙光的量子點，將此油相混合物注射入堿性水溶液中，超聲，形成水包油（O/W）膠束，通過溶劑揮發(fā)組裝成量子點納米球。利用靜電反應，將負電性量子點納米球與正電性CVN3混合，攪拌過夜，離心，得到復合物，命名為QDSN3（圖1B）。最后，QDSN3比率探針通過胞吞作用進入細胞質(zhì)，實現(xiàn)胞內(nèi)2S成像（圖1C）。

通過透射電子顯微鏡（ransmission electron microscope，EM）及動態(tài)光散射（Dynamic light scattering，DLS）對油相量子點的粒徑進行測試。通過水熱法制備的油相量子點是小且均勻的團簇，平均粒徑約為（103±12）nm（圖2A和2B），如此小的尺寸使得其包覆更加容易。由圖2C可見，合成的QDSN3復合物是球形的，且其表面光滑； 通過DLS的進一步表征（圖2D），可看出QDSN3復合物的平均粒徑約為120 nm，這樣的粒徑尺寸不僅可以保證其在血液循環(huán)運輸過程中的流暢性，且可通過胞吞作用進入細胞，從而發(fā)揮作用，實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的檢測。

本研究制備的量子點納米球為負電，CVN3為正電，將兩者均勻混合，常溫孵育過夜，通過靜電反應得到QDSN3。對比吸附CVN3前后量子點納米球的熒光光譜及eta電勢（圖3），吸附前，量子點納米球的表面eta電勢為Symbolm@@ 56 mV，而吸附CVN3之后的QDSN3復合物，其表面eta電勢變?yōu)?353 mV，這表明量子點納米球已成功地通過靜電作用結(jié)合了大量CVN3，且吸附前后發(fā)光位置不發(fā)生變化（圖3A），通過肉眼即可看到橙色熒光。眾所周知，磷脂雙分子層構成了細胞膜結(jié)構的基本骨架，其中親水的磷酸基團伸向外面，疏水的脂肪酸在內(nèi)側(cè)，其中磷酸基團帶負電，致使癌細胞表面顯負電荷，因此，正電性的QDSN3復合物更易與細胞膜接觸，通過胞吞作用進入細胞，從而發(fā)生作用。

為考察p值對QDSN3粒徑的影響，將QDSN3復合物分散到p 5～100的緩沖溶液中，37℃孵育2 h，通過觀察，發(fā)現(xiàn)其粒徑及熒光光譜都不發(fā)生變化，說明其在寬p范圍內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性（圖A和B）。同時，為了確保其與細胞膜接觸時仍能維持正電性，對QDSN3復合物在DMEM培養(yǎng)基中的性能進行了研究，如圖C所示，QDSN3的eta電位依然保持在30 mV左右，維持正電性，因此可實現(xiàn)有效進入細胞。

32QDSN3比率探針與2S作用的機理研究

2S電離生成的S

Symbolm@@ 具有較強的親核進攻能力，容易將吸電子基團N3還原成強供電子基團N2[1]，使分子熒光光譜發(fā)生變化。

為了更加明確QDSN3比率探針檢測2S的原理，本研究對其反應機理進行了研究。圖5A中，在固定激發(fā)波長的前提下（365 nm），激發(fā)QDSN3，由于CVN3的吸收波段與量子點的發(fā)射波段（綠色實線）沒有重疊，且不會被365 nm激發(fā)，因此只發(fā)射量子點的橙色熒光（591 nm）； 當存在目標物2S時，N3被還原成N2，生成CVN2，其光譜發(fā)生紅移，此時，CVN2的吸收波段（紅色虛線）與量子點的發(fā)射波段重疊，發(fā)生RE，量子點能量轉(zhuǎn)移給CVN2，探針發(fā)射紅色熒光（620 nm）（圖5B）。

33QDSN3比率探針的響應性能研究

為了驗證QDSN3比率探針對檢測2S是否具有高選擇性，設計了如下實驗： 向QDSN3比率探針溶液（330 μg/mL，水乙腈（9∶1，V/V），p=70）中分別加入不同干擾物（100 μmol/L N+，Cys，NOSymbolm@@ 2，COOSymbolm@@ ，S2O2 Symbolm@@ 3； 100 μg/mL BSA，03% 2O2，10 μmol/L GS）溶液及目標物2S（100 μmol/L），室溫下反應15 h后，測試其熒光光譜。由圖6A可見，只有當目標物2S存在時，QDSN3比率探針才會發(fā)生RE效應，發(fā)射紅色熒光，而其它細胞內(nèi)活性小分子不會影響QDSN3比率探針的波長及強度。同時，其它金屬離子、陰離子及尿素等也不會導致QDSN3比率探針的熒光光譜產(chǎn)生明顯變化。綜上結(jié)果，QDSN3比率探針對檢測目標物2S具有高選擇性，可用于體外和體內(nèi)2S的檢測。由圖6B可見，隨著2S濃度增加，量子點的橙色光強度逐漸降低，其能量轉(zhuǎn)移給了CVN2，從而紅光強度逐漸升高。通過紅光強度與橙光強度的比率可定量分析2S濃度。

Symbolm@@ 3， 100 μg/mL BSA，03% 2O2，10 μmol/L GS）溶液及目標物2S（100 μmol/L）的熒光光譜（λex= 365 nm，反應時間： 15 h）； （B）QDSN3比率探針的熒光光譜與2S濃度的對應關系圖。（QDSN3復合物溶液： 330 μg/mL，水乙腈（9∶1， V/V），p=70）

ig6（A） luorescence spectra of 2S （100 μmol/L） and different interferents （100 μmol/L N+， Cys， NSymbolm@@ 2， COSymbolm@@ ， S2O2 3QDSN3比率探針的細胞毒性考察endprint

細胞毒性是體內(nèi)應用必須關注的問題，其決定了探針在運輸過程中的生物安全性。通過M毒性實驗對QDSN3比率探針進行了研究，從圖7可見，隨著探針濃度增加，細胞存活率逐漸降低，細胞毒性略有增大。即使QDSN3比率探針與細胞的孵育濃度高達200 μg/mL，培養(yǎng)2 h后，其細胞存活率依然保持在90%以上。而在胞內(nèi)2S成像實驗中，所使用的QDSN3比率探針的濃度僅為0 μg/mL，此濃度對細胞活性無明顯影響。這再次證明本研究制備的QDSN3比率探針適用于細胞內(nèi)生物活性分子的有效分析。

內(nèi)源性2S是通過胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶分別或者協(xié)同作用（依據(jù)細胞類型），酶解L半胱氨酸及L胱硫醚產(chǎn)生的，人體血漿和多數(shù)組織中2S含量約為10～100 μmol/L[6，12，29]。將QDSN3比率探針與MC7（人乳腺癌細胞系）共同培養(yǎng)，探針的運輸和攝取過程均可以通過被包覆的量子點的熒光來示蹤。如圖8所示，空白細胞無背景熒光，當QDSN3比率探針與細胞共孵育培養(yǎng)3 h，通過胞吞作用形成核內(nèi)體進入細胞，細胞成像圖上可看到量子點的強熒光，通過Nikon分析軟件將其設定為綠色圖像； 而CVN2的光很微弱，將其設定為紅色圖像。當外加100 μmol/L 2S，繼續(xù)培養(yǎng)15 h后成像，綠色明顯減弱，紅色增強，此現(xiàn)象再次證明2S與QDSN3比率探針作用后，產(chǎn)生RE效應。通過NISElements Viewer 20 analysis軟件分析，在Merge圖像上做縱向剖面線，軟件會自動讀出此條線上對應的熒光強度數(shù)據(jù)，再用Origin軟件處理得到線狀圖，分析其上圖像強度變化，得到與前面討論相同的結(jié)果。

為了確保QDSN3探針在體內(nèi)的通用性，選擇另一種常見的惡性腫瘤細胞eLa細胞（人宮頸癌細胞系）為模型，將QDSN3比率探針與eLa共同培養(yǎng)，條件同上。 結(jié)果（圖9）與MC7細胞內(nèi)2S成像結(jié)果類似，空白細胞無背景熒光，當QDSN3探針進入細胞，細胞成像圖上可見到量子點的強熒光和CVN2的微弱紅光； 當外加100 μmol/L 2S，繼續(xù)培養(yǎng)15 h后成像，發(fā)現(xiàn)量子點的綠色減弱，CVN2紅色通道顯示強烈熒光，表明RE發(fā)生。通過在Merge圖像上的縱向剖面強度圖可讀出，Control組的綠色和紅色強度均為0，QDSN3體系的綠色和紅色強度分別約為190和2，QDSN3+100 μmol/L 2S體系的綠色和紅色的強度分別約為10和220，與細胞成像圖結(jié)果一致。

結(jié) 論

通過一步超聲乳化法制備表面含有大量羧基的負電性量子點納米球，再利用靜電反應吸附正電性CVN3制得無機有機雜化QDSN3比率探針。此探針尺寸均一，粒徑約為120 nm，可通過胞吞作用進入細胞，在寬p范圍的復雜環(huán)境下具有很好的穩(wěn)定性，且無細胞毒性。通過兩個波長的熒光強度的比率測量（620 nm /591 nm）可有效消除光源強度波動和細胞內(nèi)復雜環(huán)境等的干擾。最終實現(xiàn)MC7和eLa活細胞內(nèi)2S成像。此方法為胞內(nèi)2S及其它活性分子的檢測提供了一種新策略。

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Abstractydrogen sulfide （2S） has been confirmed as a significant endogenous gaseous signaling molecule involved in various physiological processes o monitor 2S in living cells， a rster resonance energy transfer （RE） ratiometric probe based on quantum dotcresyl violet was developed In this work， quantum dot nanospheres （QDS） were firstly synthesized via a facile ultrasonication emulsion strategy， and the mixture chloroform solution containing hydrophobic quantum dots and COOfunctionalized amphiphilic polymer were successfully transferred into the oilinwater micelle he negatively charged quantum dot nanospheres with quantum dots embedded in the polymer matrixes were successfully fabricated after the evaporation of chloroform And then， these quantum dot nanospheres were condensed with positively charged cresyl violetazide （CVN3） via electrostatic interaction to obtain the QDSN3 complexes he asprepared QDSN3 complexes were monodispersed nanospheres with an average diameter of about 120 nm hese complexes were taken up by the cell through endocytosis， and they were still stable even in wide p range In addition， the QDSN3 complexes exhibited no cellular toxicity which was verified by M assay In this ratiometric probe， CVN3 as a RE acceptor was conjugated to quantum dot nanospheres he quantum dots emitted at 591 nm and served as the RE donor； once the aryl azide on the CVN3 was reduced to aniline by 2S， the probe emitted at 620 nm he ratiometric probe allowed the elimination of interference of excitation intensity， intracellular environment and other factors urthermore， this method also offered a general protocol for preparing nanosensors for monitoring various small molecular in living cells

KeywordsQuantum dot； Cresyl violet； Ratiometric fluorescence； Cell imaging； ydrogen sulfideendprint