劉 群 ， 管政兵 ， 蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

纖維素是自然界含量最多、分布最廣的一種多糖，也是天然的可再生能源物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)中有著重要的作用。纖維素酶是降解纖維素形成葡萄糖的一組復(fù)合酶的總稱，主要包括由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。其中，β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是一種能催化水解β-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的酶，是纖維素酶系中一類重要的酶[1]。纖維素酶在外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶作用下水解成纖維二糖，纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下水解為葡萄糖[2]。β-葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1837年，Liebig等[3]首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)了該酶。纖維素酶的最適pH值一般在4.5～6.5，少數(shù)在偏堿性pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用的纖維素酶稱為堿性纖維素酶。隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，對堿性纖維素酶的需求量越來越大，它主要應(yīng)用于洗滌行業(yè)[4-6]、造紙行業(yè)、紡織行業(yè)以及醫(yī)藥食品當(dāng)中。

上世紀70年代初日本生物學(xué)家從芽孢桿菌中首先發(fā)現(xiàn)堿性纖維素酶[7]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的堿性纖維素酶基因被發(fā)現(xiàn)，包括堿性β-葡萄糖苷酶。由于植物來源的β-葡萄糖苷酶酶活比微生物來源的低的多，所以目前研究的對象主要集中于微生物中[8]。微生物來源的堿性β-葡萄糖苷酶可以應(yīng)用于紡織行業(yè)，因為β-葡萄糖苷酶在堿性條件下時更有利于形成聚合物[9]。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶在微生物循環(huán)、生產(chǎn)工業(yè)燃料、減少工業(yè)生產(chǎn)中的環(huán)境污染等方面有重大應(yīng)用。Meng等[10-11]發(fā)現(xiàn)海洋微生物中能產(chǎn)生耐堿性強的β-葡萄糖苷酶及β-葡聚糖酶。但目前海洋微生物在工業(yè)中的應(yīng)用還有一定難度。Kaur等人[12]報道了青霉菌能產(chǎn)生高濃度的β-葡萄糖苷酶，并且在堿性條件下表現(xiàn)出明顯的活性和較好的熱穩(wěn)定性但并未提及具體酶活大小。Mao等人[13]采用大腸桿菌E.coli BL21（DE3）進行β-葡萄糖苷酶的異源表達，所得重組酶的最適pH值為8.0，但當(dāng)pH值上升到9.0時剩余酶活在不到40%，且在堿性條件下穩(wěn)定性較差。

1989年，Gonzalez首次將β-葡萄糖苷酶基因克隆出來并成功表達，但限于當(dāng)時技術(shù)，表達活力并不高，粗酶液的酶活力只有0.364 U/mL[14]。朱寶龍[15]構(gòu)建的畢赤酵母工程菌所表達的重組β-葡萄糖苷酶酶活可達38 U/mL。然而，目前國內(nèi)對堿性β-葡萄糖苷酶的研究僅僅停留在探索階段，對酶活大小以及發(fā)酵產(chǎn)酶水平報道較少。因此通過基因克隆技術(shù)，構(gòu)建堿性β-葡萄糖苷酶的基因工程菌是當(dāng)前實現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶量產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。

針對以上問題，作者從蜂蜜中篩選出一株來源安全并在堿性環(huán)境中生長良好的高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4，通過對該芽孢桿菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglA克隆表達，獲得了耐堿性好、熱穩(wěn)定較好的重組β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 所用菌株是從實驗室已有的蜂蜜中篩選，經(jīng)生理生化實驗及16S rRNA基因序列分析鑒定為芽孢桿菌屬 （Bacillus），命名為 Bacillus altitudinis SYBC hb4[16]。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒：購自上海生工公司；對硝基苯基β-D-葡萄糖苷：購于Sigma（St.Louis，MO）公司；大腸桿菌 JM109 感受態(tài)細胞、16S rRNA基因測序引物、應(yīng)用細菌基因組DNA抽提試劑盒、氨芐青霉素 （Amp）、Taq酶、pColdII載體：購自TaKaRa公司；其他常規(guī)試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基 （g/L）：胰蛋白胨10，NaCl 10， 酵母粉 5；pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌 20 min。固體培養(yǎng)基再額外添加2 g/dL的瓊脂。

LB-Amp培養(yǎng)基 （g/L）：LB固體培養(yǎng)基滅菌至40～50℃后加入Amp，終質(zhì)量濃度為0.1 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4總DNA的提取 應(yīng)用細菌基因組DNA抽提試劑盒按照其操作提取Bacillus altitudinis SYBC hb4菌體基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增 根據(jù)芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4全基因組測序的序列設(shè)計上下游引物g1和g2（如表1所示）。兩條引物的5’端分別含有單一的BamI和PstI（表1中下劃線所示）限制性酶切位點。以上述芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4基因組為模板，以上述g1和g2為特異性引物，擴增出芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4中β-葡萄糖苷酶基因（bglA）全長編碼框序列（1 419 bp）。PCR反應(yīng)條件為：以基因組DNA為模板，在50 μL反應(yīng)體系中，加入5 μL 10 ×ExTaqBuffer、2 μL 25 mmol/LMgCl2、4 μL 2.5 mmol/LdNTP混合物、以及20 μmol/L上下游引物各1μL、Ex Taq 酶 （Takara 公司）1 μL 及 DNA 模板 1 μL、補水至50 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，再進行30個循環(huán) （98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用割膠回收試劑盒回收1 419 bp的DNA條帶，置4℃冰箱中保存。

表1 PCR擴增引物Table 1 Sequences of the PCR primers

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的基因克隆與序列分析 目的片段經(jīng)過割膠回收后，分別用BamHI和PstI對膠回收產(chǎn)物以及pColdII質(zhì)粒進行雙酶切。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，將pColdII質(zhì)粒與目的基因片段16℃連接過夜。將20 μL的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，在含有Amp的平板上篩選，進行菌落PCR驗證。經(jīng)BamHI和PstI雙酶切驗證陽性質(zhì)粒，并由上海尼桑生物科技有限公司完成測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。

以bglA基因為模板，用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast在線工具進行序列同源性分析。

1.2.4 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達 按體積分數(shù)1%的接種量將培養(yǎng)過夜重組大腸桿菌接種于50 mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，置于37℃、轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)至OD600值約為0.4，15℃靜置30 min，添加IPTG到終濃度0.5 mmol/L培養(yǎng)約24 h。培養(yǎng)完成后收集細胞，超聲破碎，破碎液4℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液即粗酶液，測定酶活驗證有無活性，進一步SDS-PAGE驗證相對分子質(zhì)量大小。

1.2.5 酶活測定方法 取0.5 mL粗酶液，加入0.5 mL 30 mmol/L對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷。將此反應(yīng)混合液在60℃水浴鍋反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入2.5 mL 1 mol/L的Na2CO3終止液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在400 nm波長處測定吸光值。另外，取相同條件下粗酶液在沸水中煮沸5 min后再加入底物中，混合反應(yīng)液在60℃水浴鍋反應(yīng)1 h，作為空白對照組。

酶活力單位定義：1 mL酶液每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚的酶量定義為一個酶活力單位[17]。

1.2.6 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化 將重組菌體經(jīng)破碎離心后，收集的上清液過孔徑0.22 μm的濾膜，選擇使用1 mL HisTrap HP組氨酸標(biāo)簽親和層析柱 （鎳柱）進行分離純化。純化開始時先用Blinding buffer（2 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）梯度洗脫結(jié)合上的蛋白質(zhì)，收集穿透液以及洗脫峰的蛋白質(zhì)。測定有無酶活，進一步SDS-PAGE蛋白質(zhì)條帶是否單一，分析分離純化情況。

1.2.7 重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，與不同pH的緩沖液在60℃下水浴反應(yīng)1 h，測定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH。然后在最適pH下值在， 在 30、40、50、60、70、80、90 ℃下水浴反應(yīng) 1 h，測定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度。以反應(yīng)液的最高酶活為100%計算相對酶活。

以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物研究重組β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。用pH值為7.0的酶液在60℃水浴保溫不同時間后測定酶活，并以該條件下未經(jīng)保溫處理的酶液酶活為100%，計算相對酶活。作出酶活在60℃時隨時間的變化曲線。將相同量的酶液分別在不同pH值（pH 3.0～8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 8.0～9.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，pH 9.0～10.0碳酸鈉-碳酸氫鈉）下30℃水浴保溫1 h后于60℃測定剩余酶活。以各自的初始酶活作為100%，計算相對酶活。

1.2.8 金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測定酶活，以未經(jīng)任何處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。比較不同濃度不同金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、鑒定及表達載體的構(gòu)建

2.1.1 基因bglA序列聚類分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫，以bglA基因的核苷酸序列為模板利用Blast在線工具序列對比進行同源性分析，結(jié)果顯示，其核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的β-葡萄糖苷酶Bacillus pumilus W3同源性達98%。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增 根據(jù)bglA的基因序列，設(shè)計了上下游引物。通過PCR擴增的方法以芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4的全基因組DNA為模板進行擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳驗證得到大小1 419 bp的目的片段（圖1）。將片段測序后，測序結(jié)果表明擴增得到了β-葡萄糖苷酶基因片段。

圖1 Bacillus sp.SYBC hb4的bglA基因的PCR擴增Fig.1 Amplification of bglA of Bacillus sp.SYBC hb4 by PCR

2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHI和PstI將PCR回收的目的片段進行雙酶切然后與經(jīng)過相同限制性內(nèi)切酶雙酶切過的質(zhì)粒pColdII 16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，挑選陽性克隆的轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒就行雙酶切驗證（圖2）。所得重組質(zhì)粒pColdII-bglA（圖3）經(jīng)測序結(jié)果與目的基因的堿基序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pColdⅡ-bglA的酶切驗證Fig.2 Identification of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

圖3 重組質(zhì)粒pColdⅡ-bglA圖譜Fig.3 Map of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及分離純化

2.2.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組質(zhì)粒 pColdII-bglA轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，將呈陽性克隆的重組菌保存后按照1.2.4中的方法加IPTG低溫誘導(dǎo)表達，培養(yǎng)24 h后收集菌體進行超聲破碎，破碎后低溫離心收集上清液即粗酶液測定酶活和SDS-PAGE驗證蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小。通過軟件計算bglA的蛋白質(zhì)大小為53.92×103，以不加IPTG誘導(dǎo)為對照，如圖4可以看出SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在相對分子量53×103附近出現(xiàn)了明顯的蛋白質(zhì)表達條帶。

2.2.2 重組蛋白bglA的分離純化 粗酶液使用1 mL HisTrap HP組氨酸標(biāo)簽親和層析柱（鎳柱）進行分離純化，純化結(jié)果如圖5所示。本實驗中所選用的質(zhì)粒pColdII帶有組氨酸標(biāo)簽，經(jīng)鎳柱純化的蛋白質(zhì)，具有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可以跟鎳結(jié)合，不帶有組氨酸標(biāo)簽的雜蛋白質(zhì)被去除，得到的蛋白質(zhì)相對較純。經(jīng)鎳柱純化后重組β-葡萄糖苷酶經(jīng)SDS-PAGE驗證后，通過圖5可以看出，與粗酶液相比，純化后的蛋白質(zhì)在53×103處有一條明顯的單一條帶，但是也有幾條雜帶，說明純化后蛋白質(zhì)還需進一步純化。各步純化結(jié)果如表2所示，最后所得蛋白質(zhì)的純化倍數(shù)為2.70，回收率達到85.32%。

圖4 重組表達bglA蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE anslysis of the recombinant bglA

圖5 純化后重組β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE anslysis of the purified recombinant β-glucosidase

表2 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化水平Table 2 Level of recombinant β-glucosidase be purified

2.3 重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性的研究 以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，研究不同溫度對底物反應(yīng)的影響，從而找到酶的最適反應(yīng)溫度。如圖6（a）可以看出重組的β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，在該溫度下酶活最高。當(dāng)溫度過低時，底物分子的運動速率較慢，其與酶的結(jié)合率低，所以在較低的溫度下酶活比較低；當(dāng)溫度過高時，蛋白容易變性，酶比較容易失去活性，因此溫度過高，酶活也不高。

將重組β-葡萄糖苷酶在pH 7.0、溫度60℃時水浴保溫不同時間測定剩余酶活，考察重組β-葡萄糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。如圖6（b）所示，隨著時間的增加，酶活越來越低，重組β-葡萄糖苷酶的半衰期大約在150 min，在保溫300 min后仍然有10%的剩余酶活，說明該重組β-葡萄糖苷酶有較好的溫度穩(wěn)定性。目前報道的大腸桿菌重組β-葡萄糖苷酶溫度穩(wěn)定性一般都比較好，如Wolosowska所表達重組β-葡萄糖苷酶在80℃保溫5 h后剩余酶活仍高達67%[18]。

圖6 溫度對重組β-葡萄糖苷酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperatureon the activityand stability of recombinant β-glucosidase

2.3.2 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性的研究 酶促反應(yīng)對pH值的要求很高，不同的pH值對底物與酶的結(jié)合率有很大影響，它既影響著底物的解離狀態(tài)，又影響酶分子尤其是活性中心的解離狀態(tài)。本實驗中研究了不同pH對重組β-葡萄糖苷酶的影響，如圖7（a）所示，重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH約在pH 8.0。在偏酸性條件時，pH 3.0～5.0之間，酶活較低，說明該重組β-葡萄糖苷酶在酸性環(huán)境下較為敏感，隨著酸性增強相對酶活下降較快。在pH 6.0～9.0之間時酶活力保持在40%以上，綜上所示，該重組β-葡萄糖苷酶在堿性的環(huán)境下酶活力較高。

將相同酶量的酶液在不同pH條件下水浴保溫1 h后，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，在溫度60℃、pH 8.0條件下測定重組β-葡萄糖苷酶的酶活，研究該重組β-葡萄糖苷酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性。以相對酶活作出變化曲線，如圖7（b）所示，發(fā)現(xiàn)重組β-葡萄糖苷酶在pH 6.0～9.5之間時較為穩(wěn)定，剩余酶活在70%以上。在pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，pH 3.0～5.0時，剩余酶活在40%以下。說明該重組β-葡萄糖苷酶在偏酸性條件下時不太穩(wěn)定，在中性偏堿性條件下時有非常好的穩(wěn)定。Mao等人[13]采用大腸桿菌重組表達β-葡萄糖苷酶雖然最適pH值為8.0，但當(dāng)pH值上升到9.0時，剩余酶活不到40%，且在堿性條件下穩(wěn)定性較差。作者所構(gòu)建工程菌表達β-葡萄糖苷酶在堿性條件下的穩(wěn)定性更好。

圖7 pH對重組β-葡萄糖苷酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effectof pH on the activity and stability ofrecombinant β-glucosidase

2.3.3 離子濃度對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測定酶活。測定不同離子濃度的影響時，以不加任何金屬離子的酶液為對照組。作出不同濃度不同金屬離子對酶活的影響，如圖8所示。結(jié)果表明，低濃度的金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活力的影響并不是太大，只有Ni2+抑制了40%左右。當(dāng)用5 mmol/L的金屬離子處理時，Cu2+、Fe3+、Zn2+分別抑制了84%、83%和87%的酶活。Mg2+和Mn2+對酶活有促進作用，高濃度的Fe2+、Ca2+對酶活有抑制作用。不同來源的菌株所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，金屬離子濃度對酶活的影響差異較大。如深海細菌 Martelella mediterranea[13]，Cu2+和 Zn2+對酶活有強烈的抑制作用，處理后的剩余酶活不到30%，Mg2+和Mn2+對酶活有輕微的抑制作用，K+和Na+作用下可以提高酶活。

圖8 金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of recombinant β-glucosidas

3 結(jié) 語

堿性β-葡萄糖苷酶是堿性纖維素酶的重要組成部分，具有廣泛的應(yīng)用價值，但由于國內(nèi)對其的研究報道較少，產(chǎn)酶水平較低，作者通過基因工程技術(shù)構(gòu)建異源表達載體 E.coli BL21（DE3）/pColdII-bglA實現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶的高效表達，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果分析，低溫誘導(dǎo)24 h后，重組β-葡萄糖苷酶主要以可溶性蛋白存在于破碎后的上清液中，粗酶液酶活可達到12.40 U/mL。通過對重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值 8.0， 該重組酶在 pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，實驗發(fā)現(xiàn)Mg2+和Mn2+對酶活有促進作用，5 mmol/L的Mg2+能提高約50%的相對酶活。5 mmol/L的Fe2+、Ca2+對酶活有抑制作用。

綜上所述，通過對所得重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，說明該重組β-葡萄糖苷酶在堿性條件下有較好的穩(wěn)定性，具有重大研究前景。

由于此堿性β-葡萄糖苷酶的克隆表達尚屬早期研究，相較目前β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)酶水平，此重組堿性β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量有待進一步提高。對于實現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶在紡織業(yè)、治理環(huán)境污染等方面的應(yīng)用還有待于進一步研究。

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