孔 玲， 張 慜*， 劉亞萍

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.廣東嘉豪食品股份有限公司，廣東 中山 528447）

我國是世界上有名的養(yǎng)鴨大國，咸鴨蛋是我國的主要蛋制品之一，能達到200萬噸以上的年產(chǎn)量。咸鴨蛋的蛋黃由于具有特殊的風味和口感而倍受人們的喜愛，是制作粽子、月餅、點心以及其他一些菜肴的主要原料，由此每年產(chǎn)生的副產(chǎn)物咸蛋清超過了萬噸[1]，咸蛋清由于腥味很重、咸度高、沒有吸引人的風味而往往成為棄物[2]。廢棄的咸蛋清發(fā)酵分解及腐敗后會對周圍的環(huán)境、水源造成嚴重的污染。咸蛋清中蛋白質(zhì)含量約為11%～13%，有卵白蛋白、卵伴白蛋白、卵球蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶等6種主要蛋白質(zhì)，剩下的主要是水分[3]。咸蛋清含有人體需要的8種必需氨基酸和含硫氨基酸，是一種具有較高生物學效價的全價優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[4-5]，因此咸蛋清的遺棄是蛋白質(zhì)資源的極大浪費。目前也有一些研究回收利用咸蛋清，但咸蛋清中過高的含鈉量極大地限制了它的開發(fā)利用，因此一般都會進行脫鹽處理，但是脫鹽處理能耗較高，所以咸鴨蛋仍然沒有得到廣泛的利用。因此，如何設(shè)計出更為有效的方法實現(xiàn)咸蛋清的全面利用已逐浙引起人們的關(guān)注。

近年來，蛋清水解物因為很高的營養(yǎng)價值、低的致敏性、易于消化、同時具有抗高血壓等生物活性的優(yōu)點引起了人們的關(guān)注。杜永盛對咸蛋清進行酶解得到的白蛋白肽相對分子質(zhì)量小于5 000然后再之城生物活性肽產(chǎn)品，并利用膜過濾技術(shù)去除鹽分，達到食用的要求[6]。因此，利用酶法水解回收的咸蛋清來制備多肽產(chǎn)品，成為了提高咸蛋清附加價值、減少環(huán)境污染、實現(xiàn)資源綜合利用的一條有效途徑。目前研究蛋清酶解的文章較多，但主要是對新鮮或脫鹽的咸蛋清的酶解進行研究，比如，劉雪[7]選擇胰蛋白酶對咸蛋清進行酶解；張英君[8]深入研究比較了咸蛋清的酸水解、堿水解、單酶水解、雙酶水解和發(fā)酵水解的工藝及其對產(chǎn)物理化特性的影響，從而為咸鴨蛋蛋清酶法水解制備生物活性多肽提供了理論基礎(chǔ)；任堯[9]系統(tǒng)研究鴨蛋清蛋白的單/雙酶解反應及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及活性，研究出的新型抗氧化劑安全、抗氧化活性高、營養(yǎng)價值高。

本研究中以咸蛋清為原料，通過單因素實驗得出酶解較好的工藝范圍，再通過響應面優(yōu)化得出酶解的最佳工藝條件，以提高酶解效果，從而為后續(xù)咸蛋清酶解液不經(jīng)脫鹽處理生產(chǎn)調(diào)味料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咸鴨蛋購買于無錫市濱湖區(qū)雪浪菜市場，貯存于4℃冰箱中備用，用時去除蛋黃，且用紗布過濾蛋清得到液態(tài)蛋清作為實驗原料；復合蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、水解蛋白酶，購于江蘇銳陽生物科技有限公司。

消化爐，昕瑞儀器儀表（上海）有限公司產(chǎn)品；SSW-420-2S型 水浴鍋，博迅實業(yè)（上海）有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；離心機，江蘇江陰礦山機械廠制造；UV2600型紫外分光光度計，天美(中國)科學儀器有限公司產(chǎn)品；pHS-3C型 pH計，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 咸蛋清酶解工藝生咸鴨蛋蛋清——過濾——稀釋（咸蛋清與去離子水的體積比為1∶5）——加熱變性（100℃10 min）——冷卻——調(diào)節(jié)pH（用檸檬酸和氫氧化鈉）——酶解——滅酶（100℃，10 min）——離心取上清液（4 500 r/min，25 min）——酶解產(chǎn)物。

1.2.2 單因素實驗

1）酶的選擇 選擇胰蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等5種酶，在1∶5的變性的蛋清稀釋液中各加入底物質(zhì)量分數(shù)3%，通過查閱說明書和文獻資料在5種酶的各自最適pH和溫度范圍內(nèi)控制酶解時間為3 h，酶解結(jié)束后滅酶離心取上清液，分別測定水解度和多肽質(zhì)量濃度，平均測定3次后取平均值，選出最適蛋白酶。

2）酶添加量的選擇 配制蛋清稀釋液并加熱變性冷卻后在預實驗的基礎(chǔ)上按底物質(zhì)量分數(shù)0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的添加量加入最適的蛋白酶，在該酶最適pH和溫度范圍內(nèi)酶解3 h，滅酶后離心取上清液分別測定水解度和多肽質(zhì)量濃度，平均測定3次后取平均值，選出最合適的酶添加量。文中酶添加量均為底物質(zhì)量分數(shù)。

3）最適初始pH的選擇 配制蛋清稀釋液并加熱變性冷卻后加入3%的添加量加入確定的蛋白酶，調(diào)節(jié) pH 至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在最適溫度范圍內(nèi)酶解3 h，滅酶后離心取上清液分別測定水解度和多肽質(zhì)量濃度，平均測定3次后取平均值，選出最適初始pH。

4）最適溫度的選擇 配制蛋清稀釋液并加熱變性冷卻后加入3%的添加量加入確定的蛋白酶，調(diào)節(jié) pH 至 7.0， 設(shè)定酶解溫度為 50、55、60、65、70℃，分別酶解3 h，滅酶后離心取上清液分別測定水解度和多肽質(zhì)量濃度，平均測定3次后取平均值選出最適的酶解溫度。

5）酶解時間的選擇 配制蛋清稀釋液并加熱變性冷卻后加入3%的添加量加入確定的蛋白酶，調(diào)節(jié) pH 至 7.0， 在 60 ℃下分別酶解 1、2、3、4、5、6、7、8 h，滅酶后離心取上清液分別測定水解度和多肽質(zhì)量濃度，平均測定3次后取平均值，選出最合適的酶解時間。

1.2.3 響應面優(yōu)化酶解工藝 經(jīng)過一系列單因素分析，選擇酶的添加量、初始pH、酶解溫度3個因素為響應因子，水解度為響應值，設(shè)計3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗。3個響應因子的3個試驗水平如下表1所示。

表1 響應面分析的自變量因素及編碼水平Table1VariablefactorsandcodinglevelsforBox-Behnken

1.3 分析方法

1.3.1 水解度的測定

1）游離氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的測定 根據(jù)文獻[10]采用中性甲醛滴定法并略有改進，將滅酶并冷卻后的酶解液離心取上清液，在小燒杯中加入一定體積V的濾液和60 mL蒸餾水，在磁力攪拌器攪拌的作用下，用一定濃度（C）的氫氧化鈉溶液滴定至pH值為8.2，立即加入10 mL中性甲醛溶液，繼續(xù)用氫氧化鈉溶液滴定至pH值為9.2，記錄加入甲醛后消耗氫氧化鈉溶液的體積V1?？瞻自囼炘蠟?0 mL蒸餾水，其他方法相同，加入甲醛后消耗氫氧化鈉溶液的體積V2。游離氨基酸態(tài)氮的計算公式如下（1）所示。

式中：V1為滴定樣品時加入甲醛后消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL）；V2為滴定空白試劑時加入甲醛后消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL）；C為該實驗中所用的氫氧化鈉溶液的濃度（mol/L）；V為吸取的酶解上清液的體積（mL）。

2）總氮質(zhì)量分數(shù)的測定 總氮質(zhì)量分數(shù)采用國標[11]中所述凱氏定氮法，公式如下（2）所示。

式中：V1為樣品消耗硫酸或鹽酸滴定液的體積（mL）；V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸滴定液的體積（mL）；V3為吸取消化液的體積 （mL）；c為硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；0.014 為 1.0 mL 硫酸[c（1/2H2SO4）＝1.000 mol/L]或鹽酸[c（HCl）＝1.000 mol/L]標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量（g）；m 為試樣的質(zhì)量（g）。

3）蛋白質(zhì)水解度是指蛋白質(zhì)在酶解過程中肽鍵被斷裂的程度，即酶解液中游離氨基酸態(tài)氮總含量與總氮含量的比值，計算公式如下（3）所示。

此研究中由于酶解離心后得到的沉淀質(zhì)量很小，所以上清液體積與咸蛋清質(zhì)量之比可近似取6。

1.3.2 多肽質(zhì)量濃度的測定 采用雙縮脲法[12]，以牛白蛋白為標樣， 配制成 0、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，取2 mL牛白蛋白標樣溶液與3 mL雙縮脲試劑均勻混合，放置30 min后，測定波長為540 nm時的吸光度值，并繪制標準曲線如下圖1所示。測定樣品多肽質(zhì)量濃度時，取一定量的酶解液，加入等體積10 g/dL三氯乙酸溶液，均勻混合后于4 500 r/min離心機中離心20 min得到上清液，取2mL上清液，測定方法與制備標準曲線過程一致，測定出相應的吸光度值，根據(jù)公式4計算多肽含量。

圖1 多肽質(zhì)量濃度測定的標準曲線Fig.1 Standard curve of the content of peptide.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇

不同的酶種類對不同的蛋白質(zhì)原料的酶解效果不同，為了更充分的利用咸蛋清，使咸蛋清酶解更充分，本實驗選用5種不同的蛋白酶，在各自適合的酶解條件下對咸蛋清進行酶解，以水解度和多肽質(zhì)量濃度為指標，結(jié)果如圖2所示。從此圖可以看出，木瓜蛋白酶酶解后水解度最高，且多肽質(zhì)量濃度相對也比較高，中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解后多肽質(zhì)量濃度較高，但是水解度明顯低于木瓜蛋白酶的水解度。綜合2個指標選擇木瓜蛋白酶作為最佳蛋白酶。

圖2 不同種類蛋白酶對咸蛋清酶解效果的影響Fig.2 Effect of different kinds of enzymes on the DH and PC of the salted egg white

2.2 酶添加量的選擇

相關(guān)研究表明，酶解反應速度與酶的添加量有關(guān)，當酶添加量低時酶解反應速度主要由酶的濃度控制，當加酶量較高時酶解速度則主要由底物的濃度控制，而當酶的含量過高時，酶之間的相互水解作用加強會阻礙酶對底物的水解作用[13]。從圖3可知，當木瓜蛋白酶的添加量低于3%時，水解度和多肽質(zhì)量濃度均增長迅速，接近于線性上升速度，當木瓜蛋白酶的添加量超過3%時，水解度和多肽質(zhì)量濃度的增長速度均變平緩。綜合考慮水解度和多肽質(zhì)量濃度的變化趨勢以及酶的成本問題，酶的最適宜添加量為3%。

2.3 最適初始pH的選擇

最適pH的選擇與蛋白酶和底物的種類均有關(guān)，所以針對不同蛋白酶和使用的蛋白質(zhì)需要進行試驗來確定。每一種酶只能在一定的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，pH值的大小對蛋白酶的酶活性影響較大。pH對酶解反應的影響可能是通過影響酶的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及底物的解離反應從而發(fā)揮作用的[14-15]。根據(jù)該木瓜蛋白酶的說明書選擇pH 5.5～7.5進行試驗，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，初始pH在達到7.0之前，水解度和多肽質(zhì)量濃度均呈上升趨勢，二者均在pH 7.0時達到最高值，pH超過7.0之后水解度和多肽質(zhì)量濃度將會下降，說明對該咸蛋清稀釋液而言木瓜蛋白酶的最佳初始pH值在7.0左右。

圖3 酶的添加量對咸蛋清酶解效果的影響Fig.3 Effect of added content of enzyme on the DH and PC of the salted egg white

圖4 初始pH對咸蛋清酶解效果的影響Fig.4 Effect of initial pH on the DH and PC of the salted egg white

2.4 最適溫度的選擇

酶解溫度對酶解效果的影響主要分為3個方面。①蛋白酶活性。與酶的最適作用pH一致，溫度過高會導致酶的失活，過低會造成酶活性發(fā)揮不佳；②酶解底物分子結(jié)構(gòu)。蛋白酶解底物屬于蛋白質(zhì)，在一定溫度下，蛋白質(zhì)分子中疏水性氨基酸更傾向與暴露在蛋白質(zhì)球分子外部，蛋白酶更容易與蛋白質(zhì)肽鍵作用；③酶-底物反應速率。溫度的升高會加劇溶液中分子的運動，可以促進蛋白酶與底物蛋白質(zhì)的作用機會[16]。如圖5所示，水解度和多肽質(zhì)量濃度變化曲線均隨著酶解溫度的增加呈現(xiàn)拋物線型趨勢，60℃時水解度達到最大值，65℃時多肽質(zhì)量濃度達到最大值，當超過65℃時，水解度和多肽質(zhì)量濃度明顯的下降，說明高溫造成了蛋白酶的失活。由于水解度在本研究中的意義超過了多肽質(zhì)量濃度，且溫度從60℃上升到65℃時，水解度的變化比多肽質(zhì)量濃度的變化更大，所以考慮60℃作為木瓜蛋白酶的最佳作用溫度。

圖5 酶解溫度對咸蛋清酶解效果的影響Fig.5 Impact of temperature on the DH and PC of thesalted egg white

2.5 酶解時間的選擇

酶解時間對咸蛋清酶解效果的影響，在3 h之前隨著酶解時間的延長，水解度呈上升趨勢且上升趨勢比較快，3 h后水解度保持平緩，3 h之前多肽含量呈上升趨勢，但趨勢較平緩，之后的一個小時又略有下降（見圖6），可能原因是一部分多肽被木瓜蛋白酶分解，之后基本保持穩(wěn)定。通常水解度會隨著反應時間的延長而增大，但是當酶解時間增加到一定值后，水解度的增加趨勢會逐漸減緩，且最后接近于某一固定值[17]，這可能是由于底物-底物抑制和酶解過程中酶有一定程度的失活[18]。由于當水解時間增加時，能耗會變大、成本會增加，且蛋白質(zhì)會生成一些苦味肽增加了產(chǎn)品的苦味。所以可選擇酶解時間3 h為最佳。

圖6 酶解時間對咸蛋清酶解效果的影響Fig.6 Impact of time on the DH and PC of the salted egg white

2.6 響應面優(yōu)化

2.6.1 響應面分析結(jié)果 根據(jù)單因素的結(jié)果選擇酶的添加量、初始pH、酶解溫度3個因素，采用Design-Expert 8.05b軟件程序設(shè)計3因素3水平的響應面實驗，以水解度為響應值，實驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應面實驗結(jié)果Table 2 Results of box－behnken

對實驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，分析結(jié)果得出木瓜蛋白酶酶解咸蛋清稀釋液的回歸方程為：

Y=-306.1670 2-13.336 26A+68.349 84B+3.387 56C+1.345 32AB+0.0716 06AC+6.420 00E-003BC+0.353 01A2-5.248 27B2-0.030 480C2

對擬合的二次多項式進行方差分析，結(jié)果如下表 3所示，高F值（16.60）和低P值（0.000 6）表明擬合模型能夠很好的解釋該酶解過程。較低的變異系數(shù)（CV=6.03%）表明預測值與實驗值是有較高可信度。另外，模型失擬性F值和P值分別為6.42和0.052 2說明模型預測值具有較高的準確性。而R2（0.955 3）也表明了模型可用來預測木瓜蛋白酶酶解咸蛋清稀釋液過程的變化。一般認為較低的P值和較大的F值意味著變量對響應值的影響越大，所以分析各項變量的影響（見表3）可以看出：一次項中，A影響極顯著，B和C影響相對較小，所有交互作用并沒有表現(xiàn)出顯著的影響（P＞0.05），平方項中C2影響極顯著，酶的添加量對響應值具有最大的影響（極顯著），而初始pH值和酶解溫度的影響相對較小，且初始pH值對酶解效果的影響比酶解溫度的影響更大。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.6.2 響應面交互作用的分析 根據(jù)回歸方程，做出響應面圖，見圖7～圖9。就各因素之間的交互影響而言，初始pH和加酶量對水解度的影響如圖7所示。固定酶解溫度為60℃時，pH在6.5～7.5時，水解度均隨著加酶量的增大而增大，對加酶量相同時，pH 6.0時的水解度會略高于兩側(cè)pH時的水解度。當固定初始pH為7.0時，酶解溫度和加酶量對水解度的影響如圖8所示。當酶解溫度相同時，水解度仍然隨著加酶量的增大而增大，當在同一加酶量的情況下時，酶解溫度為60℃左右時水解度達到最大值。當固定加酶量為3%時，初始pH和酶解溫度的交互作用如圖9所示。從此圖可以看出初始pH和酶解溫度均在各自中間水平時木瓜蛋白酶對咸蛋清稀釋液的水解效果最好。從此3個圖中也可以得出加酶量對水解度的影響最大，初始pH次之，這與擬合方程的方差分析結(jié)果一致。

圖7 初始pH與加酶量的交互作用的響應曲面Fig.7 Responsive surfaces of pH and the content of enzyme

圖8 酶解溫度與加酶量的交互作用的響應曲面Fig.8 Responsive surfaces of temperature and the content of enzyme

圖9 pH與溫度的交互作用的響應曲面Fig.9 Responsive surfaces of pH and temperature

2.6.3 最佳酶解工藝條件的確立 Design-Expert8.05b軟件程序分析得出，最佳酶解條件為：加酶量4%，初始pH 7.06，酶解溫度61.01℃，預測水解度為18.55%，這與李晶晶的研究結(jié)果有差異[19]，在此研究中，木瓜蛋白酶的最佳反應溫度是50℃、初始 pH 8.0，這可能與蛋清有沒有脫鹽有關(guān)，氯化鈉的存在會對酶和底物的分子結(jié)構(gòu)以及酶解動力學存在一定的影響。根據(jù)實際生產(chǎn)條件確定最佳水解條件為：加酶量4%，初始pH 7.0，酶解溫度60℃，按此酶解條件對1∶5的咸蛋清稀釋液進行驗證試驗，酶解時間為3 h，測得水解度為 18.41%，驗證了數(shù)學模型的正確性。證明響應面法對利用木瓜蛋白酶酶解咸蛋清工藝條件的優(yōu)化結(jié)果準確可靠，有實用價值。

3 結(jié)語

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應面法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解咸蛋清的工藝條件為：加酶量4%，初始pH 7.0，酶解溫度60℃，此條件下測得水解度為18.41%，可驗證響應面優(yōu)化的數(shù)學模型的正確性，該酶解液可用于后續(xù)調(diào)味品的生產(chǎn)研究。

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