候亞林，杜立行，歐柏生，孫亞如，黃 濤，黃 彥，王 藝

1.廣西中醫(yī)藥大學(南寧 530001)，2. 南寧市第十人民醫(yī)院(南寧 530105)，3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院皮膚科(南寧 530023)

生殖器單純皰疹病毒(Herpes simplex viruses type 2，HSV-2) 主要通過性接觸傳播感染人類，引起人類生殖器皰疹(Genital herpes，GH)。HSV-2陽性患者易合并梅毒蒼白螺旋體感染，且易并發(fā)各種泌尿生殖系統(tǒng)感染，增加了疾病的治療難度，給性傳播疾病的預防和控制帶來一定的負面影響[1]。目前認為，生殖器皰疹是一種尚不能徹底根治的病毒感染性性病。西醫(yī)治療本病的主要藥物有阿昔洛韋和法昔洛韋等抗病毒藥，這些藥物雖對減輕發(fā)作癥狀、減少病毒排放、縮短病程有一定作用，但都難以達到徹底根治的目的，且存在耐藥問題[2-3 ]。參芪止皰顆粒是歐柏生教授用于治療生殖器皰疹的一個有效方劑，臨床研究[4]證實其在抗生殖器皰疹復發(fā)方面具有療效，且能提高機體免疫力。為進一步探討參芪止皰顆?？笻SV-2的作用機制，我們進行了相關的體外實驗。

材料與方法

1 材 料

1.1 細胞:經培養(yǎng)、分離、鑒定無污染的人包皮成纖維細胞(Human foreskin fibroblast，HFF)，HFF常規(guī)培養(yǎng)傳代,以上均由湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院伍參榮教授實驗組完成。

1.2 病毒：HSV-2，由廣州博特生物技術公司提供。HSV-2經HFF活化增殖，收獲病毒作為毒種。

1.3 藥物：參芪止皰顆粒(藥物組成：太子參、知母、黃柏各12g，黃芪、白花蛇舌草、大青葉、板藍根、魚腥草、絲瓜絡、薏苡仁各30g，柴胡8g，甘草3g)，采用培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產的農本方免煎配方顆粒劑,由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房提供，用無菌蒸餾水溶解成1g/ml濃度，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。阿昔洛韋片(Acyclovir，ACV，國藥準字H19994080，南京瑞爾醫(yī)藥有限公司生產，批號：201304112021，規(guī)格：0.1g/片)，用DMEM培養(yǎng)液初溶，超聲15min藥粉充分溶解，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，配成40mg/ml濃度的藥物母液。以上溶液均 4℃保存，實驗時用DMEM維持液稀成所需濃度。

1.4 試劑及儀器：四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，胎牛血清(FBS)，均購自Sigma;含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶細胞消化液，GIBCO公司產品；DMEM培養(yǎng)液，北京鼎國生物技術有限公司產品；Thermo Fisher Scientific 細胞培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司；酶聯(lián)免疫儀，Genios pro，Setifl number， 601000003，芬蘭；倒置顯微鏡，Nikon，Ecllipss Tsl00，日本。

2 方 法

2.1 病毒毒力測定：將對數(shù)生長期的HFF用EDAT的0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基配成細胞密度為l×105個/ml單細胞懸液，接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔1×104個細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)，細胞長滿單層進行實驗。HSV-2原液分別用培養(yǎng)基依次10倍稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-66個稀釋度。96孔板中的HFF單層用PBS沖洗2次，然后將上述制備好的各稀釋度病毒懸液接種于HFF單層，每孔100μl，各設5個復孔，并設正常細胞對照孔，37℃孵育2h后吸取出病毒液，加入新的細胞培養(yǎng)液，200ul/孔，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察記錄細胞病變(Inhibitation of cytopathic effect，CPE)情況，用Reed-Muench法計算病毒的致半數(shù)細胞病變的滴度(Tissue culture infectious dose,TCID50)。CPE程度判定標準:(-)示細胞無病變,(+)示25%的細胞出現(xiàn)病變,()示25%～50%的細胞出現(xiàn)病變,()示50%～75%細胞出現(xiàn)病變,()示75%～100%細胞出現(xiàn)病變。

2.2 藥物毒性測定：參芪止皰顆粒、ACV用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋為6個濃度(參芪止皰顆粒為10mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.32 mg/ml；ACV為5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.31 mg/ml、0.16mg/ml)。將HFF接種至96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長成單層后，將稀釋好的各濃度藥物加入到已長成細胞單層的96孔細胞培養(yǎng)板200μl/孔，每濃度做5個復孔，同時設正常細胞對照孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察記錄HFF的形態(tài)變化和生長情況，培養(yǎng)3d后，吸出孔內液體，PBS洗兩遍，加入MTT液20μl，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO液200 μl/孔，充分振蕩溶解孔內結晶，用酶聯(lián)免疫儀測定570 nm處吸光度值[5]，計算細胞存活率和細胞的半數(shù)毒性濃度(50%cytotoxity concentration，CC50)。

2.3 藥物直接抑制病毒復制作用測定：將參芪止皰顆粒、ACV分別自最大無毒濃度倍比稀釋6個濃度，各濃度藥液分別加入100TCID50病毒液l00 μL混合后，再將藥物病毒液加入96板HFF單層上，每一濃度設5個復孔，設正常細胞對照組、病毒對照組及陽性藥ACV對照組，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)，MTT法測得各組吸光度值,具體方法同方法2中步驟，并計算病毒抑制率、半數(shù)抑制病毒有效濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)和治療指數(shù)(Therapeutic index，TI) 。

2.4 藥物對病毒感染細胞的治療作用：長滿96孔單層細胞去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。各孔加病毒液100μl,37℃吸附2 h后吸出，用PBS洗去病毒殘留液，加入不同濃度含藥維持液100μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72h。MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，并計算藥物對病毒抑制率、EC50和 TI。

2.5 藥物預防病毒感染細胞作用：長滿單層的HFF先加入不同濃度含藥細胞維持液，37℃， 5%CO22 h，棄去含藥細胞維持液，PBS洗去孔內殘留的藥液，加100TCID50HSV-2作用細胞，37℃ 5%CO2，2 h，棄去殘留病毒液，加入細胞生長維持液，置37℃，5%CO272 h，MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，并計算藥物對病毒生長抑制率。

2.6 藥物對病毒復制抑制的時相作用：在HSV-2感染細胞的不同時間點即：0 h，2 h，4 h，6 h，8 h,10 h加入含2.5mg/ml參芪止皰顆粒細胞維持液，100μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)，MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，檢測藥物對病毒復制的抑制作用。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析方法進行，先進行方差齊性檢驗，若方差齊，則應用One．way ANOVA進行整體方差分析，用LSD方法進行組間多重比較，若方差不齊，則應用Welch法進行整體方差分析，用DunnettT3方法進行組間多重比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 病毒毒力 生物光學倒置顯微鏡下，正常HFF呈梭形，細胞膜界限清晰，胞漿透明度好，細胞形態(tài)完整，見圖1中1；病毒所致的細胞病變表現(xiàn)為細胞變圓、腫脹、可見多核巨細胞或融合細胞(圖1中2-7)。用Reed-Muench計算病毒的TCID50為10-4。

圖1 生物倒置顯微鏡下不同稀釋倍數(shù)的HSV-2致HFF細胞病變觀察(20×10)

2 藥物毒力 參芪止皰顆粒在10 mg/ml濃度時細胞存活率仍有73.52%，說明其對HFF的CC50值大于10 mg/ml，表明參芪止皰顆粒對HFF 的毒性作用小。ACV在0.63 mg/ml時細胞存活率為51.14%，ACV在0.31 mg/ml時細胞存活率為64.84%,最大無毒濃度為0.16 mg/ml。

3 藥物直接抑制病毒復制作用 參芪止皰顆粒液、ACV各濃度對病毒具有抑制作用，且藥物濃度越大，抑制作用越明顯，與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。計算參芪止皰顆粒液的EC50值為0.30 mg/ml，TI>36，表明其對HSV-2感染HFF具有一定保護作用。陽性對照藥ACV對HSV-2感染HFF顯示出良好的保護作用，其EC50為0.018 mg/ml，TI值為67。

4 藥物對病毒感染細胞的治療作用 參芪止皰顆粒液、ACV各濃度的病毒抑制率與病毒對照組比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，且有明顯的量效關系。經計算參芪止皰顆粒液的EC50值為0.60 mg/ml，TI>25。結果提示參芪止皰顆粒液對病毒感染后病毒的復制有一定的治療作用。

5 藥物預防病毒感染細胞作用 參芪止皰顆粒在5mg/ml時，病毒抑制率不超過50%(僅38.94%)，表明參芪止皰顆粒不能阻斷HSV-2病毒入侵細胞。提示參芪止皰顆粒對HSV-2感染細胞無預防作用。

6 藥物不同時間點對病毒復制的影響 病毒感染HFF后各個時間點藥物組最后測得的吸光度值與病毒對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HSV-2感染細胞0 h，2 h后加入藥物病毒增殖抑制率達到68.65%、73.26%；感染4 h，6 h后加入藥物，病毒增殖抑制率分別達到59.32%，40.70%；但病毒感染細胞后8 h再加入藥物進行干預，藥物對病毒復制抑制作用則明顯減弱，隨著病毒進入細胞的時間延長，藥物對病毒的復制的抑制效果也隨之下降，10 h時病毒增殖抑制率僅為4.65%。提示參芪止皰顆粒液對HSV-2的抑制作用主要在病毒感染細胞的早期，可能在病毒DAN合成期。

討 論

生殖器皰疹是主要由HSV-2引起的性傳播疾病，以生殖器和肛周出現(xiàn)群集性水皰和淺表潰瘍?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。生殖器皰疹可引起胎兒感染和新生兒皰疹，在艾滋病流行地區(qū)，生殖器皰疹增加了HIV 感染的危險性，女性生殖器皰疹還與宮頸癌的發(fā)生密切相關，由于皰疹反復發(fā)作，部分患者可發(fā)生抑郁癥，嚴重影響患者的身心健康和生活質量[6-7]。病毒細胞內復制是復雜但又程序化的過程即：吸附、穿入、脫衣殼、DNA復制、轉錄、翻譯、蛋白質合成、核衣殼組裝和病毒的釋放等許多個環(huán)節(jié)，HSV-2也是如此，因此影響上述復制循環(huán)中任一環(huán)節(jié)的藥物，均可能具有抗HSV作用[8]。目前核苷類是抗HSV的有效藥物，其中無環(huán)鳥苷的分子基礎是作用于病毒復制的關鍵環(huán)節(jié)，抑制HSV-2 DNA復制而不抑制細胞DNA的合成，而且其臨床應用中耐藥的情況很常見，同時又有一定的腎毒性，因此如何在中草藥中尋找高效的抗HSV-2藥物勢在必行。參芪止皰顆粒方中黃芪、白花蛇舌草、板藍根和大青葉都有抑制病毒的作用，方中部分中藥具有廣譜抗病毒作用，促進機體誘生干擾素，從而達到抑制病毒復制,延緩復發(fā)的作用[9]。本實驗研究表明，與細胞對照組比較，參芪止皰顆粒對HFF毒性作用??；其對HSV-2感染HFF具有一定保護作用；對病毒的復制具有一定的抑制作用；對HSV-2病毒吸附入侵細胞沒有阻斷作用；其對HSV-2復制的抑制作用時相主要在感染后0 h、2 h、4 h，是在病毒復制周期的生物合成階段，可能在DNA復制階段，與劉建國[10]結果類似。表明參芪止皰顆粒是一種有效的抗HSV-2感染的方劑，其療效機制值得進一步研究。

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