李 敏，高 凱，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽 712046)

肝纖維化是各種急慢性肝病常見的病理改變，其病理機(jī)制是肝臟中HSC持續(xù)激活轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞，增殖合成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc,ECM)并過度沉積產(chǎn)生肝纖維化[1]。課題組研究表明，柴胡、黃芩配伍水煎液對(duì)大鼠肝纖維化模型及CCl4損傷L02細(xì)胞有良好的改善作用[2]，作用機(jī)制與TLR4-NF-κB信號(hào)通路有一定關(guān)聯(lián)[3]。本研究探討柴胡、黃芩中有效成分柴胡皂苷d-黃芩苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC作用，進(jìn)一步從TLR4-NF-κB信號(hào)通路的角度闡釋其抗肝纖維可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1 試劑與儀器 大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)，購自灝洋生物公司；1640培養(yǎng)基、TLR4、NF-κB一抗、二抗購自博士德生物科技公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；胰酶，購自Trypsin。TAK-242購自Invivo Gen 公司，BYA 11-7082購自江蘇碧云天生物科技公司；HA、LN、PCIII、IV-C試劑盒購自北京永輝生物科技有限公司。

CO2培養(yǎng)箱、雙人型超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO)；倒置顯微鏡(奧特BDS200)；酶標(biāo)儀(美國BioTek ELx808)；離心機(jī)(湘儀L530)。

2 實(shí)驗(yàn)藥品

2.1 柴胡皂苷d、黃芩皂苷購自陜西中鑫生物技術(shù)有限公司，參考文獻(xiàn)[5-6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，柴胡皂苷d和黃芩皂苷以1∶2.5的比例溶于DMSO中，以下簡(jiǎn)稱SB。

2.2 CCl4溶液的制備:CCl4與DMSO各100 ml混勻，無血清培養(yǎng)基稀釋至6 mmol/L。

3 HSC-T6培養(yǎng)及藥物處理 HSC-T6于1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代。至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，1.5×106個(gè)/ml濃度接種過夜。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組( 無藥物處理) ，CCl4誘導(dǎo)組(6mmol/L CCl4作用 6 h)，給藥組(6mmol/L CCl4作用 6 h后，再用2.5、5、10 μg/ml的SB作用24 h)，TAK-242、BYA 11-7082組(6mmol/LCCL4作用 6 h后，再用TAK-242 10 mol/L、BYA 11-7082 2 mol/L作用24 h)。

4 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)大鼠HSC增殖抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)]×100%。

5 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC分泌HA、LN、PCIII、HA的影響 培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參照試劑盒使用說明書，應(yīng)用Elisa法檢測(cè)HA、LN、PCIII、HA含量。

6 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC的TLR4和NF-κBp65的mRNA水平的影響 培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR的方法，檢測(cè)的TLR4和NF-κBp65mRNA表達(dá)，PCR使用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

7 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)24h后，胰酶消化收集，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑裂解，離心，取上清，蛋白定量，細(xì)胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性。用 10% SBS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h，一抗4 ℃ 過夜，二抗室溫 2 h，洗膜后，加ECL 發(fā)光液，曝光。TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平用目的條帶積分吸光度值(Integrated absorbance，IA) 與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的 IA 比值定量表示。

結(jié) 果

1 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，顯著促進(jìn)HSC細(xì)胞增殖(P<0.01)，SB對(duì)HSC細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，劑量為10 μg/ml時(shí)，作用最明顯；TAK-242 和BYA-11 7082也對(duì)HSC細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。結(jié)果見表2。

表2 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC 增殖的影響

注：與CCl4干預(yù)組比較，**P<0.01，*P<0.05

2 SB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影響 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，細(xì)胞培養(yǎng)液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明顯升高，SB、TAK-242 和BYA-11 7082對(duì)HA、LN、PCIII、IV-C分泌具有顯著抑制作用。結(jié)果見表3。

表3 SB對(duì)經(jīng)CCl4誘導(dǎo)的HSC-T6分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影響

注：與CCl4干預(yù)組比較，**P<0.01，*P<0.05

3 RT-PCR檢測(cè)HSC中TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，SB、TAK-242 和BYA-11 7082則對(duì)TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，其中SB 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 SB對(duì)CCl4干預(yù)后HSC的TLR4NF-κB基因表達(dá)的影響

注：與CCl4組比較，*P<0.05

4 Western Blot法檢測(cè)HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)增強(qiáng)，SB、TAK-242 和BYA-11 7082對(duì) HSC細(xì)胞TLR4和NF-κBp65 蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，其中SSB- 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表5。

表5 CQ對(duì)CCl4干預(yù)后HSC的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

注：與CCl4組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

HSC在多種因素刺激后轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞，大量增殖合成ECM，在肝內(nèi)過量沉積導(dǎo)致肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活后可調(diào)控下游NF-κB，導(dǎo)致炎性介質(zhì)大量釋放，造成肝臟損害[4-5]?？梢?，TLR4-NFκB信號(hào)通路異常與HSC異常增殖導(dǎo)致的肝纖維化密切相關(guān)[6]。文獻(xiàn)[7-8]及課題組研究發(fā)現(xiàn)，柴胡黃芩配可明顯防治大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能與TLR4 -NFκB信號(hào)通路調(diào)控的炎癥反應(yīng)有關(guān)[2]。柴胡皂苷d、黃芩苷為柴胡、黃芩的主要活性成分，兩者均有良好的抗肝纖維化作用[9-10]，本實(shí)驗(yàn)研究柴胡皂苷d、黃芩苷對(duì)CCL4誘導(dǎo)活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κBp65基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其抗肝纖維可能的作用機(jī)制。

結(jié)果表明，CCl4干預(yù)后，HSC大量增殖，其培養(yǎng)液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。可見，CCl4促進(jìn)HSC增殖，并導(dǎo)致HA、LN、PCIII、IV-C分泌增加，促進(jìn)肝纖維化。SB干預(yù)后，HSC增殖受到抑制，且HA、LN、PCIII、IV-C含量也降低，可見，SB有一定抗肝纖維化作用。同時(shí)，CCl4干預(yù)HSC后，細(xì)胞中TLR4和NF-κBp65 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，SB干預(yù)后，兩者mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯降低，其中SB 10 μg/ml時(shí)(P<0.05)作用最為顯著；應(yīng)用TLR4的拮抗劑ATK-242，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯降低，應(yīng)用NF-κBp65拮抗劑BAY 11-7082后，NF-κBp65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)也明顯降低，TLR4 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)沒有明顯變化?？梢姡琒B表現(xiàn)出一定抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制之一是可能是通過調(diào)控TLR4-NF-κB信號(hào)通路，具體的調(diào)控機(jī)制，尚需深入研究。

[1] Sahin H，Trautwein C，Wasmuth H E．TLR4 stresses the liver[J]．Gut，2012，61：1241-1242.

[2] 王 斌，李 敏，侯建平.基于TLR4 -NFκB信號(hào)通路的柴胡-黃芩藥對(duì)抗肝纖維研究[J].中藥藥理與臨床，2015，31(3)：103-106.

[3] 李小菲，李 靜，王義雯，等.柴胡、柴胡和黃芩配伍對(duì)肝細(xì)胞損傷體外作用[J]. 吉林中醫(yī)藥，2016，36(2):176-180.

[4] Zhu Q，Zou L，Jagavelu K，etal．Intestinal decontaminationinhibits TLR4 dependent fibronectin-mediated cross-talk between stellate cells and endothelial cells in liver fibrosis inmice[J]．Hepatol，2012，56(4)∶893-899.

[5] Min Yu,Danbing Shao,Jian Liu,etal．Effects of ketamine on levels of cytokines，NF-κB and TLRs in rat intestine during CLP-induced sepsis[J].International Immunopharmacology,2007，7 (8):1076-1082.

[6] 李 冬，戴立里，余斌斌，等.丹參素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(8)：724-727.

[7] 鄭麗娜，韓 濤，王寶恩，等.柴胡對(duì)肝星狀細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，7(4)：502-503.

[8] 劉林華，許景薇，萬玉英，等.豬牙皂正丁醇提取物體外對(duì)肝星狀細(xì)胞活性的影響研究[J].抗感染藥學(xué)，2015,12(6)：832-834.

[9] 郭景珍，萬 方，李 忻，等．柴胡皂苷d 對(duì)二甲基亞硝胺致肝纖維化大鼠炎癥相關(guān)因子的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(11)：970-972.

[10] 劉志勇，葉 軍，薛東英.黃芩苷對(duì)肝纖維化大鼠相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013 ，20(12) ：18-21.