蘭麗君,陳繼博,呂美紅,馬全紅

蘇州大學神經科學研究所(蘇州 215123)

GPCRs 家族是體內最大的蛋白質超家族，已鑒定出在人的基因組中有上千個基因編碼GPCRs[1]，雖然它們的序列同源性較低，但在結構上都具有螺旋-環(huán)-螺旋的七次跨膜結構，并且GPCRs中有一半是內源性配體的受體，具有一個胞外端和胞內端，通過偶聯 G 蛋白和其他信號通路接受細胞外信號傳遞到細胞內部。GPCRs在神經傳遞過程、細胞增殖、器官特異性中是非常重要的[2]。GPR50屬于 GPCRs 家族，是位于 X 染色體 Xq28 上的孤獨 G 蛋白偶聯受體、褪黑激素相關受體(melatonin related receptor)[3-4]，主要分布在成年哺乳動物腦內的垂體、下丘腦、海馬等多個部位，主要表達在神經元上[5- 6]。已有相關研究表明：GPR50在很多精神類疾病，如：雙極情感障礙(Bipolar affective disorder，BPAD)、抑郁癥(Major depressive disorder，MDD)以及精神分裂癥(Schizophrenia)等神經系統疾病中有不可或缺的作用[7-10]。最近的研究亦發(fā)現：GPR50基因在ASD患者體內有兩個突變位點：Δ502-505和T532A，而且這種突變只發(fā)生在男性個體上[11]。但是到目前為止，GPR50在大腦中的功能尚不清楚。

為了探究GPR50在大腦發(fā)育中的作用，我們首先分析了GPR50在不同時期的表達情況，又進一步探究了GPR50對發(fā)育的影響，包括對神經元數目和中間神經元的影響，以及對樹突發(fā)育的影響。我們的結果顯示：GPR50敲除影響海馬區(qū)域鈣網膜蛋白(Calretintin，CR)陽性中間神經元的數目，而不影響皮層深層和淺層神經元的數目。另外，成年的GPR50敲除小鼠腦皮層錐體細胞的頂樹突方向異常。因此，GPR50在大腦發(fā)育中具有重要功能。

材料與方法

1 材 料 野生型小鼠C57BL/6J在蘇州大學提供的 SPF 級實驗動物中心飼養(yǎng)，C57BL/6J背景的GPR50敲除小鼠(G-/Y)和野生型小鼠(G+/Y)雜交來繁殖；GPR50 antibody(Santa Cruz)、γ-tubulin(Sigma)、Tbr1 antibody(Abcam)、Cux1 antibody(Santa-Cruz)、CR(Abcam)、FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD Neuro Technologies,Inc)。

2 方 法

2.1 GPR50小鼠的基因鑒定：剪取長度約為0.5 cm的小鼠尾部組織，提取DNA。然后用如下的引物進行PCR：引物PNF-seq5’-FATCCGGGGGTACCGCGTCGAG-3’；GPR50-zptR 5’-TACCTCCACCTCCTCCAGCAT-3’；GPR50-zptF5’-CAGAGTCACCTGGGACTTGCT-3’；LAR3 5’-CACAACGGGTTCTTCTGTTAG TCC-3’；GPR50-G-zptF 5’-CAGAGTCACCTGGGACTTGCT-3’；GPR50-G-wt-tR 5’-GTAGCAGTAACGGTTGATGGCAATG-3’。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。

2.2 Western blot檢測蛋白的表達：將E12、E14、E16、E18、P0小鼠用手術剪和鑷子取出全腦，立即置于冰上，并分離出皮層和海馬部分，用預冷的PBS清洗兩遍，再放入研磨器中，加入裂解液(Brain lysis buffer和蛋白酶抑制劑(1∶50))；在冰上進行研磨裂解至腦組織成勻漿狀，測濃度，并在樣品中加入 4×上樣緩沖液混勻，使蛋白質變性。配制12% SDS-PAGE分離膠和5%的SDS-PAGE濃縮膠，待凝固后按次序上樣，孵育GPR50抗體，以γ-tubulin作為內參，凝膠成像儀進行成像。

2.3 組織免疫熒光染色：將確定基因型的小鼠在體視顯微鏡下取出完整的腦組織。在4°C 條件下，用4%的多聚甲醛固定24 h，然后換成15%、30%的蔗糖梯度脫水沉底。用冰凍切片機橫切海馬區(qū)，切片厚度14 μm，貼在載玻片上。晾干后用0.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。10%的FBS室溫封閉2 h。一抗Tbr1(特異標記第六層神經元的maker)、Cux1( 特異標記淺層神經元的maker)以及CR(特異標記中間神經元的maker)(1∶200)在4 °C條件下孵育過夜?；厥找豢?，用0.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。二抗Tbr1：Rabbit555，Cux1和CR：Rabbit 488(1∶800)在室溫避光孵育1 h，棄二抗，再次用0.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。待切片避光晾干后用含DAPI的封片劑封片。

2.4 高爾基染色：將高爾基染色試劑盒內的A、B液按1∶1震蕩混勻后放入4 ml的EP管中，避光貯存；第2天，取G+/Y、G-/Y小鼠大腦放到配好的AB液中，浸泡14～16d，注意避光；15d后，取出浸泡好的腦袋，蘸干AB液，準備切片；將切片機的箱體溫度和凍臺溫度都調至-22℃，準備好明膠包被過的片子，將腦袋放在-80℃冰箱內40 min，然后再避光放到切片機中箱體溫度內2 h，制作包埋劑座，固定腦袋，按100 μm切片貼于載玻片上，避光晾干。將晾干的片子放在玻片槽內，用雙蒸水洗兩次，4min/次；用工作液浸泡10 min(工作液配制：溶液D、溶液E和雙蒸水按1∶1∶2配100 ml，現配現用)；用雙蒸水洗兩次，4 min/次；在50%、75%、95%乙醇中各清洗4 min；再在無水乙醇中洗4次，4 min/次；二甲苯中透明13 min；用中性樹脂封片，待拍片。

結 果

1 GPR50基因敲除小鼠的獲得和鑒定 為了研究GPR50在大腦中的作用，本研究利用了GPR50基因敲除(GPR50-/-)的小鼠。該小鼠在南京模式動物中心定做，GPR50的第二外顯子通過同源重組被lacZ-neo cassette序列替代(圖1)。GPR50基因敲除小鼠可正常存活、可繁育，且在體重、運動等方面均無明顯異常。GPR50雜合子(GPR50+/-，雌性)小鼠通過與雄性C57BL/6N野生型小鼠回交進行保種。因為GPR50基因位于X染色體上，雌性GPR50+/-雄性野生型小鼠(WT)通過雜交可以獲得WT小鼠 (雌性或者雄性)、GPR50+/-(雌性)和GPR50-/Y(雄性)小鼠。通過提取小鼠尾巴基因組DNA，并利用對應的引物進行PCR實驗。實驗結果如圖2所示：圖中199號和200號小鼠為雜合子雌性小鼠，201為WT小鼠，205號為GPR50基因敲除的雄性小鼠。

2 GPR50在胚胎發(fā)育過程中有較高的表達 已有研究表明：GPR50主要分布在成年哺乳動物腦內的垂體、下丘腦、海馬等多個部位，而在細胞水平上，則主要表達在神經元上[5-6]。為了研究GPR50在大腦中的作用，我們首先取WT小鼠胚胎發(fā)育的不同時期(E12-P0)的腦組織，勻漿裂解后，通過Western blot檢測了GPR50蛋白在腦內的表達情況，GPR50在發(fā)育的不同時期均有表達(圖3)，統計結果表明：從E12到E18有增加的趨勢，而從P18到P0呈現減少的趨勢(圖4)。這表明GPR50在大腦發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。

圖1 GPR50基因敲除小鼠的獲得示意圖(GPR50的第二外顯子被敲除)

圖2 基因鑒定的PCR代表圖

圖3 GPR50在不同發(fā)育階段野生型小鼠腦內表達

圖4 GPR50在不同發(fā)育階段野生型小鼠腦內表達統計圖

3 GPR50敲除不影響P1小鼠大腦皮層深層和淺層神經元的數目 大腦皮層是高度特化且有著嚴格分層的結構，從內到外一共分為6層，即Ⅰ～VI層，每一層都有自己特有類型的神經元和膠質細胞[12]。且它們的產生具有一定的時間和空間性，由SVZ區(qū)域的神經干細胞按照由內而外的順序逐步分化而產生的，比如先產生深層神經元，而后是淺層神經元。每層神經元產生的時間和數量都是受嚴格控制的[13]。在發(fā)育階段，神經元產生的時間節(jié)點和數量的變化會導致大腦發(fā)育異常，從而導致神經系統疾病[14-15]。我們的前期工作已表明：GPR50亦在神經干細胞上表達，且影響干細胞的增殖和分化[16]。因此，我們首先分析了GPR50敲除后對P1時期小鼠大腦皮層不同層的神經元數目的影響。我們分別利用深層和淺層神經元的特異性蛋白標志物Tbr1和cux1(Tbr1是第VI層神經元的蛋白標志物，Cux1是II-IV神經元的蛋白標志物)在P1時期的小鼠腦內進行免疫熒光染色。如圖5～7所示：Tbr1+細胞定位于第VI層。然而，我們的統計結果顯示：與WT組小鼠相比，GPR50敲除后并未影響深層神經元的數目。利用同樣的方法，我們亦分析了淺層神經元的數目有無變化，結果顯示：GPR50敲除組小鼠大腦皮層內淺層神經元(cux+細胞)的數目也無明顯改變。以上結果提示：在發(fā)育后期，GPR50敲除并不影響淺層和深層神經元的數目。

4 GPR50敲除導致P1小鼠海馬CR陽性中間神經元數目顯著增多 神經環(huán)路是大腦神經系統的基礎，神經元與神經元之間依賴于突觸相互聯系，這些彼此聯系的神經元構成一定的神經環(huán)路來發(fā)揮大腦的高級功能。根據其在突觸聯系中的作用，大腦皮質神經元主要可以分為興奮性神經元和抑制性神經元(中間神經元)。雖然中間神經元在大腦皮層總神經元中的數目相對較少，僅占20%左右，但在神經元環(huán)路功能上卻起到了至關重要的作用。已發(fā)現多種神經系統疾病的發(fā)生，如癲癇、自閉癥、精神分裂癥等，均與中間神經元環(huán)路發(fā)育異常有關。GABA能中間神經元是腦中一種主要的抑制性神經元，和興奮性神經元一起起著腦內興奮-抑制的動態(tài)平衡，CR+中間神經元是GABA

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖5 P1時期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠皮層anti-Tbr1抗體標記的神經元(紅色)和DAPI標記所有細胞的細胞核(藍色)的代表圖

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖6 P1時期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠皮層anti-Cux1抗體標記的神經元(綠色)和DAPI標記所有細胞的細胞核(藍色)的代表圖

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖7 Tbr1陽性和Cux1陽性細胞數目的統計圖

能中間神經元的一種。因此，本研究亦探討了GPR50對中間神經元的影響。我們的結果顯示：P1時期的海馬區(qū)CR+中間神經元主要分布在DG區(qū)域的顆粒層細胞外側，GPR50敲除組的每張14 μm厚的切片中約(44±4)個CR+中間神經元， WT組小鼠組數目則為(29±4)個，GPR50敲除組CR+中間神經元數目顯著高于WT組小鼠，這個結果提示GPR50敲除后，抑制性中間神經元增多，可能打破了神經網絡的抑制性與興奮性中間神經元之間的平衡(見圖8)。

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖8 GPR50敲除增加海馬鈣網膜蛋白陽性中間神經元數目。p1時期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠海馬DG區(qū)用CR抗體標記中間神經元(綠色)和DAPI標記所有細胞的細胞核(藍色)的代表圖

5 GPR50敲除導致大腦皮層錐體神經元頂樹突方向紊亂 樹突發(fā)育是神經系統功能形成的一個基本過程，神經元之間的交流需要樹突和軸突之間形成突觸。樹突像一根分叉的天線，接受來自不同方位的軸突輸入來的信號，樹突的長度和分支多少決定其接受信號的廣度和強度。錐體神經元是皮層內一種主要類型的神經元，它有一個頂樹突直接延伸到大腦皮層表面，和幾個從胞體伸出的基樹突。為了探索GPR50對樹突發(fā)育的影響，我們利用高爾基染色觀察樹突的形態(tài)。我們發(fā)現：在WT組小鼠皮層內，可以清晰可見頂樹突的形態(tài)，他們排列有序，均垂直地延伸至皮層表面，而在GPR50敲除小鼠皮層的在兩個半腦連接處，有的神經元的頂樹突變短甚至消失，排列紊亂(見圖9)。

圖9 GPR50敲除小鼠皮層內錐體神經元頂樹突方向紊亂

討 論

在胚胎發(fā)育過程中，GPR50在大腦內的表達，暗示GPR50可能參與神經系統的發(fā)育過程。此外，我們亦發(fā)現：GPR50影響海馬區(qū)中間神經元的數目和皮層錐體神經元的頂樹突的發(fā)育，這些結果表明了GPR50在腦發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。事實上，已有大量數據證實GPR50是多種神經系統疾病的風險因子[7-10]。

我們發(fā)現GPR50 KO小鼠P1時期無論是深層還是淺層的神經元數目并沒有變化，而我們之前的結果卻表明GPR50 KO小鼠來源的神經干細胞在體外能更多的分化成神經元[16]，我們推測：在發(fā)育早期，GPR50敲除首先導致神經干細胞的增殖和分化能力的增強，但在發(fā)育后期，GPR50敲除可能又會產生相反的作用，所以最終在發(fā)育后期神經元數目并無明顯變化。另一方面，在發(fā)育后期，GPR50的敲除后，增多的神經元可能發(fā)生了凋亡。所以，為了驗證這一點，在接下來的研究中，我們將分析不同發(fā)育時期神經元的數目和凋亡情況。對中間神經元的檢測的結果初步顯示，GPR50 KO小鼠的海馬區(qū)CR+中間神經元數目顯著增多。這提示GPR50 可能參與調控神經網絡的興奮性和抑制間的平衡。目前，抑制和興奮性神經元的失衡已經被證明和多種神經疾病聯系在一起，例如精神分裂癥、自閉癥和阿爾茨海默疾病等。但CR是GABA能中間神經元眾多亞型中的一種，另外還包括小清蛋白 (Parvalbumin，PV)，生長抑素(Somatostain，SST)以及神經肽 Y (Neuropeptide Y，NPY)等，因此，下一步我們將評估其他類型的中間神經元，和通過腦電圖來確定GPR50在這方面的作用。

總之，我們通過本研究得出：①GPR50在胚胎發(fā)育過程中有較高的表達；②GPR50敲除后不影響P1小鼠大腦皮層深層和淺層神經元的數目，但可以使CR陽性中間神經元數目顯著增多；③ GPR50敲除也導致大腦皮層椎體神經元頂樹突方向紊亂。

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