柳銀黎，李忠勇,2

(1. 原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國原子能科學研究院，北京 102413)

阿爾茲海默病(AD)是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆誘因，細胞外老年斑(SPs)是其重要神經(jīng)病理學特征之一[1-2]。SPs由β淀粉樣蛋白(Aβ)構成，以Aβ為生物標志物，研究放射性藥物，利用PET技術，可以協(xié)助早期診斷AD[2-4]。近年來，大量小分子被用于Aβ顯像，而且已有多種PET藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)上市許可[5]，如6-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-3-(4-甲氨基)苯乙烯基吡啶([18F]Florbetapir)和(E)-1-(4{2-[2-(2-[18F] 氟乙氧基) 乙氧基] 乙氧基}苯基)-2-(4-甲氨基)-乙烯([18F]Florbetaben)[6-7]，均具有給電子基團和大共軛結構，這可能是其表現(xiàn)出對Aβ高親和性的重要原因[8]。對[18F]Florbetapir進行修飾得到一系列18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物，也具有類似結構特點，有Aβ顯像的潛力。

本研究對苯乙烯基氮雜環(huán)化合物進行18F標記，制備[18F]Florbetapir、5-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-2-(4-甲氨基)苯乙烯基吡啶(18F-SPy5)、2-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-5-(4-甲氨基)苯乙烯基嘧啶(18F-SPm2)、5-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-2-(4-甲氨基)苯乙烯基嘧啶(18F-SPm5)，并進行質(zhì)量檢驗，為研究18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物作為Aβ顯像劑的可行性提供參考。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

BP211D型分析天平：德國SARTORIUS AG；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MH-2800A型多用恒溫箱：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；CRC-25R型活度計：美國CAPINTEC.INC；LC-20AT型高效液相色譜儀、LC-6AD型半制備液相色譜儀：日本SHIMADZU CORPORATION。

1.2 主要試劑與材料

[18F]F-溶液：原子高科股份有限公司；4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮雙環(huán)[8.8.8]二十六烷(K2.2.2)：化學純，德國MERCK KGAA；無水碳酸鉀(K2CO3)、氫氧化鈉(NaOH)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；濃鹽酸(HCl)：優(yōu)級純，36%～38%，北京化工廠；醋酸銨(NH4OAc，HPLC級)、高效液相色譜乙腈(HPLC-CH3CN，99.9%+)、乙醇(C2H5OH，USP)：美國SIGMA-ALDRICH；無水乙腈(CH3CN)、無水二甲基亞砜(DMSO)：分子篩級別，比利時ACROS ORGANICS；滅菌注射用水(H2O)、氯化鈉(NaCl)注射液：石家莊四藥有限公司；Light C18固相萃取小柱(C18柱，WAT023501)、Light QMA固相萃取小柱(QMA柱，WAT023525)：美國WATERS CORPORATION；半制備反相高效液相色譜柱(Zorbax Eclipse XDB-C18, 9.4 mm×250 mm, 5 μm)、反相高效液相色譜柱(Zorbax Eclipse XDB-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)：美國AGILENT TECHNOLOGIES INC。

2 實驗方法

2.1 無水18F-K2.2.2/K2CO3的制備

將回旋加速器得到的[18F]F-溶液通過活化的QMA柱，1 mL K2.2.2/K2CO3溶液(14.4 g/L K2.2.2和3 g/L K2CO3的乙腈/去離子水混合溶液，V乙腈/V去離子水= 96∶4)淋洗[9]，淋洗液于100 ℃及氬氣流下蒸干，再加入1 mL無水乙腈， 100 ℃及氬氣流下蒸干制備18F-K2.2.2/K2CO3備用。

2.2 標記化合物制備

2.2.118F標記反應條件

18F-SPy5、18F-SPm2、18F-SPm5等18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物，與[18F]Florbetapir結構類似，示于圖1。

選擇[18F]Florbetapir放化合成過程為代表，研究標記反應階段各因素對標記反應的影響。無水18F-K2.2.2/K2CO3中加入1 mL含[18F]Florbetapir標記前體化合物(E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯的無水DMSO溶液，油浴加熱進行標記反應，改變前體化合物溶液濃度、反應溫度、反應時間，考察對標記率的影響，確定標記反應的優(yōu)化條件。

圖1 18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物的化學結構Fig.1 Chemical structures of 18F labelled styryl nitrogenous heterocycles

2.2.2[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的合成

無水18F-K2.2.2/K2CO3中加入1 mL相關標記前體化合物((E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(6-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-3-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}嘧啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(2-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}嘧啶-5-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯)的無水DMSO溶液，優(yōu)化條件下進行18F標記反應，加入0.25 mL 10% HCl溶液，120 ℃油浴加熱5 min，加入0.825 mL 1 mol/L NaOH溶液和8 mL H2O[10-11]。

2.3 分離純化

2.3.1C18柱分離 放化合成后的混合溶液通過活化的C18柱，1 mL HPLC-CH3CN淋洗，淋洗液中加入1 mL HPLC-CH3CN和2 mL HPLC-H2O。

2.3.2半制備HPLC純化 C18柱分離后的溶液通過0.22 μm微孔濾膜過濾后，半制備HPLC(流動相55% CH3CN/45% 20 mmol/L NH4OAc，流速4 mL/min，時間20 min)純化，采用自動集樣器分管接收組分，每2 mL(即0.5 min)一管，收集完成后，分別測量每管活度，收集需要組分并用水稀釋5倍。

2.3.3產(chǎn)物溶液制備 半制備HPLC純化后的溶液通過活化的C18柱，0.5 mL乙醇淋洗，淋洗液中加入4.5 mL NaCl注射液，通過0.22 μm微孔濾膜過濾，得到產(chǎn)物溶液。

2.4 質(zhì)量控制

目測產(chǎn)品顏色和澄明度，pH試紙測定pH，HPLC(流動相55% CH3CN/45% 20 mmol/L NH4OAc，流速1 mL/min，時間20 min)測定放化純度、化學純度和比活度。

3 結果與討論

3.1 18F標記反應條件優(yōu)化

3.1.1標記前體化合物濃度對標記率的影響

固定反應溫度120 ℃、反應時間10 min，改變標記前體化合物溶液濃度0.1～2 g/L，濃度對標記率的影響結果示于圖2a。由圖2a結果可知，在選擇的濃度范圍內(nèi)，當濃度較低于0.1 g/L時，標記率低于10%，增加溶液濃度，標記率隨濃度的增加而增加，1 g/L時標記率約68%，但是繼續(xù)增加溶液濃度，標記率降低，可能是標記前體化合物量過多，導致副反應發(fā)生。

3.1.2反應溫度對標記率的影響

固定溶液濃度1 g/L、反應時間10 min，改變反應溫度100～140 ℃，溫度對標記率的影響結果示于圖2b。由圖2b結果可知，在選擇的溫度范圍內(nèi)，標記率隨溫度的增加而增加，120 ℃時標記率約68%，但是繼續(xù)增加溫度，標記率降低，可能是反應溫度過高，導致副反應發(fā)生。

圖2 標記反應條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of labeling reaction conditions

3.1.3反應時間對標記率的影響

固定溶液濃度1 g/L、反應溫度120 ℃，改變反應時間2.5～15 min，反應時間對標記率的影響結果示于圖2c。由圖2c結果可知，在選擇的反應時間范圍內(nèi)，隨反應時間的增加，標記率逐漸增加，10 min時標記率約68%，但是繼續(xù)增加反應時間，標記率降低，可能是反應時間過長，導致副反應發(fā)生。

綜上，選擇用于[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5制備的條件為：溶液濃度1 g/L，反應溫度120 ℃，反應時間10 min。

3.2 標記化合物的制備

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成過程示于圖3。[18F]F-具有親核性，但也具有強堿性，容易與質(zhì)子溶劑形成氫鍵，導致親核性降低。利用親核取代反應進行18F標記時，通常選用非質(zhì)子溶劑，實驗選擇無水DMSO作為反應溶劑，V底反應瓶中加入標記前體化合物的DMSO溶液后，溶解18F-K2.2.2/K2CO3，形成淡黃色或黃色透明溶液，標記反應結束后，透明溶液顏色加深。18F標記階段的標記率分別為48%、62%、36%和27%，說明在選擇的條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)相關前體化合物的18F標記，雖然標記率較條件研究中低，但均能滿足相關實驗研究的需求，因此未進一步優(yōu)化調(diào)整。

圖3 18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物合成路線圖Fig.3 Radiosynthesis scheme of 18F labelled styryl nitrogenous heterocycles

18F標記反應后，得到帶Boc保護的中間產(chǎn)物，利用鹽酸脫除Boc基團，加入鹽酸后，均變?yōu)闊o色透明溶液，加熱反應后，又均變?yōu)辄S色透明溶液，此時得到目標產(chǎn)物。大量未參與標記反應的標記前體化合物也脫除Boc基團，同時OTs基團也因水解而脫除，生成相應的副產(chǎn)物。得到的含有目標物的混合溶液中含有過量的鹽酸，利用氫氧化鈉中和，并加入8倍DMSO量的水，將溶液由油相體系轉變?yōu)樗囿w系，得到粗產(chǎn)物。

3.3 分離純化

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的粗產(chǎn)物中，含有大量的副產(chǎn)物，通過C18柱和半制備HPLC兩步法分離純化，其中C18柱分離除去游離的[18F]F-和K2.2.2、K2CO3、DMSO等，半制備HPLC分離化學組分中的副產(chǎn)物。粗產(chǎn)物、C18柱分離后產(chǎn)物、半制備HPLC純化后產(chǎn)物的HPLC分析譜圖分別示于圖4～圖6。各化合物對照品[19F]Florbetapir、19F-SPy5、19F-SPm2和19F-SPm5的HPLC分析圖譜示于圖7。從圖4～7結果可以看出，C18柱可以有效分離目標物和游離的[18F]F-，但是其化學組分中的副產(chǎn)物無法有效分離，而半制備HPLC可將化學組分中的副產(chǎn)物有效分離。

圖4 粗產(chǎn)物的HPLC分析譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of crude products

圖5 C18柱分離后產(chǎn)物的HPLC分析譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of products after separated by C18 cartridge

半制備HPLC純化譜圖示于圖8，分別收集11.0～12.5 min、11.0～12.5 min、7.0～8.5 min和6.0～7.5 min組分，目標產(chǎn)物在乙腈和水的混合溶液中，而且濃度較低，利用C18柱進行富集轉化，得到[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的制劑溶液，校正后的放化產(chǎn)率分別為17%、30%、20%和15%。

手工操作影響因素較多，放化合成時間較長，放化產(chǎn)率較低，目前，18F藥物的生產(chǎn)已實現(xiàn)自動化，其原理與實驗室合成一致。自動化合成可以排除各種不確定因素的影響，合成過程穩(wěn)定性和可重復性均較高，合成時間短，這對于短半衰期核素的放化合成尤為重要。由于本工作屬于前期研究，限于實驗條件，未采用自動化合成。

3.4 質(zhì)量控制

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的質(zhì)量控制結果列于表1。由表1結果可知，[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的制劑溶液均為無色澄清透明液體，pH均為7～8，放化純度均>99%，化學純度均>98%，比活度均為1.09×107～5.11×107MBq/g，各參數(shù)均能夠滿足相關實驗研究的需求。

圖6 半制備HPLC純化后產(chǎn)物的HPLC分析譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of products after purified by Semi-preparative HPLC

圖7 參比化合物的HPLC分析譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of reference compounds

圖8 半制備HPLC純化譜圖Fig.8 Semi-preparative HPLC chromatograms for the purification

表1 質(zhì)量控制結果Table 1 Results of quality control

4 小結

本研究以[18F]Florbetapir放化合成過程為代表，研究確定了18F標記反應階段的優(yōu)化條件：標記前體化合物的溶液濃度1 g/L，反應溫度 120℃，反應時間10 min。將該條件用于相關18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物制備，均能實現(xiàn)前體化合物的18F標記，結果滿足實驗研究的需求。本研究在此基礎上制備了高放化純度、高比活度的[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5制劑溶液，為研究18F標記苯乙烯基氮雜環(huán)化合物作為Aβ顯像劑的可行性提供參考。

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