韓東衛(wèi)，朱蕾，張宇馳，于鵬洋，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

2型糖尿病胰島素抵抗是一種典型性代謝類(lèi)疾病，可引起機(jī)體多器官多系統(tǒng)的代謝紊亂[1]。代謝組學(xué)是關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律的科學(xué)。相比于全基因組、蛋白質(zhì)組，其代謝物信息更簡(jiǎn)單，可直接將代謝信息與病理生理過(guò)程中生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而了解機(jī)體生命活動(dòng)的代謝過(guò)程[2]。因此近年來(lái)代謝組學(xué)在2型糖尿病胰島素抵抗的研究中得到廣泛應(yīng)用。

花旗澤仁由西洋參、薏苡仁、澤瀉等組成，具有補(bǔ)氣、健脾、生津、清熱、利濕之功，是臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗的經(jīng)驗(yàn)方。本研究通過(guò)觀察花旗澤仁對(duì)大鼠尿液代謝組學(xué)的影響，探討花旗澤仁改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠55只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。

1.2 藥物與試劑

西洋參、澤瀉及薏苡仁購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局；鏈脲佐菌素(STZ,BIOSHARP公司)；馬來(lái)酸羅格列酮(天津葛蘭素史克有限公司)；諾和靈R生物合成人胰島素(丹麥諾和諾德公司)；亮氨酸-腦啡膚標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；羅康全活力型血糖試紙(德國(guó)羅氏診斷有限公司)。

1.3 儀器

液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent 公司)；VORTEX-GENIE 2渦旋混合儀(美國(guó)Scientific 公司)。

2 方法

2.1 花旗澤仁水煎液的制備

分別取西洋參15 g、薏苡仁30 g、澤瀉15 g，合并3次水煎液，過(guò)濾后水浴濃縮至每毫升含0.54 g生藥的藥液，4℃保存。

2.2 造模

參照艾靜和魏偉等[3-4]方法復(fù)制2型糖尿病胰島素抵抗模型。

2.3 樣品采集與預(yù)處理

血液樣本采用大鼠眼眶靜脈叢取血。尿液樣本另取SD大鼠10只，于給藥前及給藥后12 h采集尿液樣本，給藥前禁食12 h，給藥劑量為1 mL/100 g。取尿液100 μL，加入400 μL低溫甲醇，震蕩混勻30 s，12 000 rpm低溫離心15 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.4 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)檢測(cè)

采用血糖儀檢測(cè)FBG。取適量血清，按胰島素放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)FINS。采用李光偉法[5]計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

2.5 色譜檢測(cè)條件

儀器分析平臺(tái)為L(zhǎng)C-Q/TOF-MS，分離色譜柱為C18色譜柱。色譜分離條件為：柱溫為40℃；流速0.35 mL/min；流動(dòng)相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～6 min，20% B；6～9 min，50% B；9～13 min，95% B；13～15 min，95% B。進(jìn)樣量為4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。

2.6 質(zhì)譜條件

正離子模式條件為：毛細(xì)管電壓4 kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600 L/h、萃取錐孔4 V。負(fù)離子模式條件：毛細(xì)管電壓3.5 kV、錐孔電壓50 kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度300℃、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣700 L/h、萃取錐孔4 V。離子掃描時(shí)間0.03 s、掃描時(shí)間間隔0.02 s、數(shù)據(jù)采集范圍：50～1 000 m/z。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)的比較

如表1所示，與模型對(duì)照組比較，花旗澤仁組空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)水平明顯下降(P<0.001)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)的比較

注：與空白對(duì)照組比較，△△△P<0.001，△△P<0.01；與模型對(duì)照組比較,***P<0.001，*P<0.05

3.2 大鼠尿液代謝組學(xué)分析

3.2.1 原始色譜圖檢查

如圖1和圖2所示，通過(guò)對(duì)QC樣本的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行可視化檢查，樣品圖譜的穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合代謝組學(xué)分析要求。

圖1 正模式下QC樣本的總離子流圖

圖2 負(fù)模式下QC樣本的總離子流圖

3.2.2 差異性代謝產(chǎn)物的篩選及鑒定

結(jié)果顯示,空白尿液和給藥12 h后尿液在正離子檢測(cè)模式下共發(fā)現(xiàn)13種差異性代謝物，負(fù)離子模式下共發(fā)現(xiàn)11種差異性代謝物，差異性代謝物數(shù)據(jù)如表2與表3所示。

表2 正模式下的差異性代謝物

表3 負(fù)模式下的差異性代謝物

4 討論

代謝組學(xué)能夠探討機(jī)體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，客觀真實(shí)的反映機(jī)體已經(jīng)發(fā)生的改變。目前已廣泛應(yīng)用于糖尿病的中醫(yī)證候本質(zhì)研究、代謝產(chǎn)物、發(fā)病機(jī)制、并發(fā)癥及藥物評(píng)價(jià)等方面，對(duì)2型糖尿病的早期診斷、預(yù)防、治療具有重要的指導(dǎo)意義[6]。課題組前期研究表明，中藥復(fù)方花旗澤仁具有降低空腹血糖、改善高血脂狀態(tài)、調(diào)節(jié)脂肪因子水平及抗氧化應(yīng)激的作用，可以在一定程度上改善胰島素抵抗[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)從尿液代謝組學(xué)角度，利用UPLC-Q/TOF-MS儀器對(duì)兩組尿液樣本(空白尿液與給藥后12 h尿液)進(jìn)行代謝組學(xué)全譜分析。結(jié)果表明,花旗澤仁主要參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與代謝過(guò)程，其中4-Guanidinobutanoic acid(4-胍基丁酸)參與體內(nèi)精氨酸和脯氨酸的生物合成，研究表明，精氨酸通過(guò)激發(fā)β細(xì)胞內(nèi)已存儲(chǔ)胰島素的釋放，對(duì)胰島β細(xì)胞有較強(qiáng)的興奮作用[10]。王覲研究表明[11]，脯氨酸可以降低KM小鼠餐后2 h血糖及曲線下面積。Homogentisic acid(尿黑酸)及Dopaquinone(多巴醌)參與苯丙氨酸和酪氨酸的代謝過(guò)程。高貝貝[12]研究結(jié)果顯示，芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)濃度升高可能會(huì)增加糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。差異代謝物Gentisic acid(龍膽酸)主要參與芳香烴的生物降解過(guò)程，表明花旗澤仁可能具有降解芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)的作用，進(jìn)而改善糖尿病胰島素抵抗。此外，PGK2(磷酸甘油酸激酶2)是一種參與經(jīng)由糖酵解葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶[13]。Niacin(煙酸)在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝、組織呼吸的氧化過(guò)程及糖類(lèi)無(wú)氧分解的過(guò)程[14]。

綜上所述，中藥復(fù)方花旗澤仁改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制可能與蛋白質(zhì)的合成與代謝、芳香烴的生物降解過(guò)程、體內(nèi)脂質(zhì)代謝組織呼吸的氧化過(guò)程以及糖類(lèi)無(wú)氧分解等過(guò)程有關(guān)。

[1] 葛鵬玲,張宇馳,韓東衛(wèi),等.花旗澤仁對(duì)胰島素抵抗大鼠胸主動(dòng)脈血管張力、血清一氧化氮含量以及骨骼肌胰島素受體mRNA 基因表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(6):23-27.

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