龍惠,林文新,孫昌潔,鄧錦玲,張玉艷,吳小純

(廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095)

肝癌是中國和世界上常見的腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。肝癌的發(fā)生和慢性乙肝有著密切的聯系。慢性乙型肝炎是臨床上常見的傳染病，在我國1～59歲的人群中HBV攜帶率高達7.18%，HBV病毒能夠促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]。有研究表明,患有慢性乙肝的患者中約有25%左右死于與乙型病毒感染相關的肝硬化、肝癌[5]。所以研究阻止乙型肝炎相關性肝癌發(fā)生的治療藥物具有重要的意義。中醫(yī)對于慢性乙型病毒性肝炎早有“脅痛”“酒癖”“酒疸”“酒臌”等認識，在慢性乙肝及乙型肝炎相關性肝癌的治療中有獨特的療效[6]。健脾活血方能夠發(fā)揮健脾理氣活血的作用，前期研究表明健脾活血方能夠明顯改善內毒素誘發(fā)的大鼠急性肝損傷[7]。但是健脾活血方對乙型肝炎相關性肝癌的治療作用還不清楚。本研究在LPS處理人肝癌細胞株HepG2的基礎上進行健脾活血方治療，分析健脾活血方對LPS誘導的肝癌細胞遷移、侵襲和EMT的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

Lipopolysaccharide(LPS，Enzo life sciences，濃度1 mg/mL)；Transwell細胞培養(yǎng)板(BD)；matrigel基質膠(BD)；HRP標記的GAPDH優(yōu)質內參(康誠生物)；Anti- Vimentin、N-cadherin、E-cadherin(Abcam)；HRP標記的Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)(Southern biotech)；顯微鏡CKX41,U-CTR30-2(Olympus)；拍照系統(tǒng)MC30(廣州市明美科技有限公司)；酶標儀multiscan MK3(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 中藥健脾活血方制劑血清制備

中藥健脾活血方全方制劑按照白術12 g、姜黃8 g、丹參5 g、白芍10 g、澤瀉5 g、葛根15 g、枳殼5 g、五味子5 g的配比組成，對實驗小鼠采用灌胃的方法，3天共進行6次(每隔12 h一次)，在末次灌胃1 h后從腹腔靜脈取血，無菌條件下分離血清，加熱滅活備用。生理鹽水灌胃小鼠血清作為對照。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和處理

人肝癌細胞株HepG2(武漢大學細胞中心)接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放入飽和濕度、5% CO2、溫度為37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞的生長狀況，待細胞生長狀態(tài)基本恢復正常后，取對數期細胞進行實驗。將對數期HepG2更換培養(yǎng)液并添加LPS(濃度0.1 mg/ml)誘導24 h；然后將LPS誘導的HepG2細胞分為治療組(添加10%含有健脾活血方藥物血清培養(yǎng)，命名為LPS+治療組)以及空白對照組(添加10%不含健脾活血方藥物血清培養(yǎng)，LPS+對照組)，兩組持續(xù)采用LPS(濃度0.1 mg/ml)處理。正常培養(yǎng)的HepG2(添加10%不含健脾活血方藥物血清培養(yǎng)，不添加LPS)作為陰性對照組(命名為HepG2組)。

1.2.3 Transwell遷移和侵襲檢測

細胞遷移：收集各處理組細胞，計數1×105個細胞，用100 μl無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細胞小室的上室，在下室加入600 μl完全培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2的條件下孵育48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗滌一次，結晶紫染色10 min，1×PBS洗滌一次，并拍照統(tǒng)計。

細胞侵襲：首先4℃溶解Matrigel過夜，用預冷的無血清培養(yǎng)基以1∶3的體積比稀釋Matrigel，取40 μl加入預冷的Transwell小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；其余步驟同細胞遷移。

1.2.4 Western blot檢測

處理48 h后離心收集細胞并采用RIPA裂解液加入PMSF混勻，冰上裂解細胞30 min。12 000 rpm離心20 min取上清。BCA法測定蛋白總濃度，12% SDS-PAGE分離總蛋白，每孔上樣量為30 μg；然后采用濕轉的方式以300 mA轉膜30 min，將蛋白轉移到PVDF膜；采用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS稀釋一抗(anti-N-cadherin：1∶2 000；anti-Vimentin：1∶1 000；anti-E-cadherin：1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；HRP標記的Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(稀釋比1∶4 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；于暗室中進行曝光拍照并進行灰度分析。

1.3 數據統(tǒng)計

2 結果

2.1 健脾活血方抑制LPS誘導的HepG2細胞遷移

各組HepG2細胞遷移采用Transwell檢測，結果如圖1所示。

對遷移結果進行統(tǒng)計分析如表1所示。該結果表明HepG2組、LPS+對照組和LPS+治療組三組之間差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。LSD兩兩分析表明,和HepG2組相比，LPS+對照組中HepG2細胞遷移數顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007)；和LPS+對照組相比，LPS+治療組中HepG2細胞遷移數顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖1 Transwell檢測HepG2組、LPS+對照組和LPS+治療組中遷移HepG2細胞的代表圖

表1 各組HepG2細胞的遷移數比較

2.2 健脾活血方抑制LPS誘導的肝癌細胞的侵襲

各組HepG2細胞侵襲采用Transwell檢測，HepG2細胞侵襲結果如圖2所示。

圖2 Transwell檢測HepG2組、LPS+對照組和LPS+治療組中侵襲HepG2細胞的代表圖

對侵襲結果進行統(tǒng)計分析如表2所示。該結果表明HepG2組、LPS+對照組和LPS+治療組三組之間侵襲細胞數差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。LSD兩兩檢測表明：和HepG2組相比，LPS+對照組中HepG2細胞侵襲數顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.021)；和LPS+對照組相比，LPS+治療組中HepG2細胞侵襲數顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。

表2 各組HepG2細胞的侵襲數比較

2.3 健脾活血方抑制LPS誘導的肝癌細胞的EMT

各處理組EMT相關蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達采用Western blot檢測，Western blot代表圖如圖3所示。

圖3 Western blot檢測N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白的表達

灰度統(tǒng)計結果如表3所示。該結果表明HepG2組、LPS+對照組和LPS+治療組三組之間N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表達差異都顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。LSD兩兩檢測表明：和HepG2組相比，LPS+對照組中N-cadherin和Vimentin蛋白表達顯著增加，E-cadherin蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.011，0.027，<0.001)；和LPS+對照組相比，LPS+治療組中N-cadherin和Vimentin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P值分別為<0.001，0.003，<0.001)。

表3 各組N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表達量比較

3 討論

LPS在慢性乙型肝炎向肝硬化以及肝癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，有研究表明LPS在慢性重型乙型肝炎組中的表達明顯高于慢性乙型肝炎組和對照組[8]。LPS刺激人肝癌細胞和原代鼠肝細胞通過TLR4信號通路能夠上調肝癌細胞的增殖以及炎癥因子IL-6和IL-8以及TNF-α的表達，還能夠通過上調泛素樣蛋白酶(ubiquitin-like protease，USP)18損害肝臟先天免疫反應[9-11]。腫瘤的遷移和侵襲會導致腫瘤轉移，是腫瘤患者死亡的重要原因之一，而EMT能夠使上皮細胞失去細胞極性，獲得更高的遷移與侵襲能力。LPS能夠刺激炎癥細胞來調節(jié)腫瘤微環(huán)境中細胞因子水平，誘導血管生成，促進腫瘤入侵以及轉移[12]。Lai FB等[13]研究表明,LPS能夠促進肝癌的遷移和侵襲。本研究發(fā)現和正常培養(yǎng)HepG2細胞相比，LPS處理能夠顯著增加肝癌HepG2細胞的遷移和侵襲(P均<0.05)；同時顯著增加Vimentin和N-cadherin蛋白的表達，降低E-cadherin蛋白的表達(P均<0.05)。以上結果表明LPS處理能夠促進肝癌HepG2細胞發(fā)生EMT、遷移和侵襲，和Lai FB等[13]研究結果類似。

中藥健脾活血方由白術、姜黃、丹參、白芍、澤瀉、葛根、枳殼和五味子組成。有研究表明中藥健脾活血方在治療肝硬化腹水中能夠明顯改善臨床癥狀、提高白蛋白，療效優(yōu)于常規(guī)西醫(yī)治療[14]。對于中晚期肝癌患者以TACE化療聯合健脾活血中藥治療能夠可延長患者生存時間[15]。但是中藥健脾活血方對LPS誘導的HepG2細胞的遷移侵襲作用以及機制還不清楚。本研究結果表明和LPS+對照組相比，健脾活血方治療能夠顯著抑制LPS誘導的HepG2細胞的遷移、侵襲(P均<0.05)，降低Vimentin和E-cadherin蛋白的表達(P均<0.05)，促進N-cadherin蛋白的表達(P<0.05)，該結果表明健脾活血方治療能夠阻止LPS誘導的HepG2細胞發(fā)生遷移侵襲以及EMT。

總之，LPS處理能夠促進肝癌HepG2細胞發(fā)生EMT、遷移和侵襲，而健脾活血方治療能夠阻止LPS誘導的HepG2細胞發(fā)生轉移侵襲以及EMT。但是關于健脾活血方治療肝癌的臨床應用有待進一步研究。

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