廖亮英，蔡光先，周賽男

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

補陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，是益氣活血法的代表方劑[1]。臨床常用于治療中風(fēng)后遺癥，療效確切。研究表明，中風(fēng)恢復(fù)期神經(jīng)功能重建的可能機制與影響神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)控基因有關(guān)，Bag-1基因是一種新型的、獨立的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，是較為肯定的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因[2]，本試驗擬選用補陽還五湯為研究對象，通過觀察其對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后凋亡基因Bag-1的影響作用，探討其量效關(guān)系的特點，為其臨床應(yīng)用劑量提供參考。

1 材料

1.1 藥物

補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片，均由湖南省中藥超微工程技術(shù)研究中心提供，試驗前補陽還五湯超微飲片用沸水保溫浸泡20 min，補陽還五湯傳統(tǒng)飲片按常規(guī)方法煎煮，浸泡液與煎煮液按要求配至所需濃度，補陽還五湯傳統(tǒng)飲片成人臨床日用量為180 g生藥。

1.2 試劑

DMEM/F12粉(Hyclon公司)；bFGF(R&D公司)；B27添加物、EGF(GLBCO公司)；胰酶、EDTA、Qtracker Cell Labeling Kit Protocol、 Rabbit Anti-Bag-1抗體(武漢博士德生物工程公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(長沙麗欣生物公司)；水合氯醛、0.01 MPBS、TritonX-100、雙氧水、甲醇、無水甘油(長沙麗欣生物公司)；SABC試劑盒、AEC顯色劑、多聚賴氨酸包埋玻片、水溶性封片劑(北京中杉生物公司)。

1.3 動物

SD大鼠80只，清潔級，體質(zhì)量(280±20)g，雌雄各半，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2003-0002。

1.4 儀器與器械

BX51光學(xué)顯微鏡、圖像分析系統(tǒng)、倒置顯微鏡、CCD攝像頭(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(Shell lab 公司)；鼠腦立體定位儀(四川)；臺式離心機(湘儀)；MilliQ超純水儀(Millopor 公司)；E60冰凍切片機(英國Shamton公司)；貝利粉碎機(濟南貝利公司)。

2 方法

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代

參考本研究團隊建立的方法[3],從新生3～5 d SD大鼠腦內(nèi)分離純化。

2.2 模型制備

采用大腦中動脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型。待動物清醒24 h后，采用Zea Longa神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)初步評價動物造模情況。

2.3 細(xì)胞標(biāo)記

[4]采用量子點的標(biāo)記方法。

2.4 細(xì)胞移植

參考文獻(xiàn)[5]采用側(cè)腦室細(xì)胞移植方法。

2.5 動物分組與給藥

將造模后的SD大鼠按神經(jīng)功能缺損評分進(jìn)行分級，隨機分為5組：模型組(A組)、M+空白移植組(B組)，M+移植組(C組)，M+移植+補陽傳統(tǒng)飲片組(4.57 g/kg，D組)，M+移植+補陽超微飲片組(1.52 g/kg，E組)，每組15只。動物手術(shù)后分別觀察存活7、14和28 d的情況，每組每個時間點各5只。各組分別灌胃給藥，模型組和模型加等體積空白移植組給予等體積生理鹽水，給藥體積均為10 ml/kg，每天給藥1次。

2.6 神經(jīng)功能評價

參照文獻(xiàn)[3]分別于處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，包括9個項目：1)抬起鼠尾觀察左前肢屈曲情況；2)同上觀察右前肢屈曲情況；3)當(dāng)前肢在桌面并將鼠尾攔起使后肢抬起向后，觀察左后肢屈曲；4)如前觀察右后肢屈曲；5)抵抗向左側(cè)的推力；6)抵抗向右側(cè)的推力；7)站立向左傾斜平板的能力；8)站立向右傾斜平板的能力；9)垂直位置。每項按程度計0～4分，共計36分。

2.7 動物處理

動物注射細(xì)胞后分別存活7、14、28 d。經(jīng)10%水合氯醛(1 ml/250 g)麻醉后，沿胸骨左緣剪開胸腔，按文獻(xiàn)進(jìn)行處理，剝離心包，暴露心臟，6號針從心尖插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速用預(yù)冷生理鹽水(10 ml/min)，無血污后改滴入4%冷多聚甲醛(5～10 ml/min)，先快后慢，約100 ml。開顱取腦，去額極，小腦，4%多聚甲醛后固定1 h，依次放入15%、20%、30%蔗糖-多聚甲醛液沉底24 h。OTC包埋，冰凍切片機冠狀連續(xù)切片，15 μm，每隔20張取4張切片。

2.8 免疫組織化學(xué)方法檢測Bag-1

嚴(yán)格按照試劑說明書完成。陽性細(xì)胞計數(shù)：AEC顯色為紅色。單標(biāo)免疫組化時，細(xì)胞呈胞核染色顯紅色為陽性細(xì)胞。單標(biāo)每個腦片在10×10視野下隨機取4個視野，分別計數(shù)免疫陽性細(xì)胞數(shù)。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析及組間t檢驗，所涉及的統(tǒng)計學(xué)檢驗均以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞標(biāo)記情況

在神經(jīng)干細(xì)胞液中加入量子點標(biāo)記液后，絕大多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞被標(biāo)記，而且由其傳代分化的細(xì)胞亦被標(biāo)記。

3.2 補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對大鼠神經(jīng)功能積分的影響

與A組比較，C、D、E組在7、14、28 d神經(jīng)功能積分均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與B組比較，C、D、E組在7、14、28 d神經(jīng)功能積分均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與C組比較，D、E組在7、14、28 d神經(jīng)功能積分均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與D組比較，E組在7、14、28 d神經(jīng)功能積分均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。C、D、E組在7 d、14 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，各組動物腦缺血后都存在有一定程度神經(jīng)功能缺損，但隨著缺血時間的逐漸延長，各組動物神經(jīng)功能積分有所上升。說明各組動物的神經(jīng)功能在逐步恢復(fù),并且腦缺血后E組促神經(jīng)功能恢復(fù)的效果優(yōu)于D組，結(jié)果見表1。

表1 補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對大鼠神經(jīng)功能積分的影響分)

注：組間比較：與A組比較，△P<0.01；與B組比較，＊P<0.05＊＊P<0.01；與C組比較，##P<0.01；與D組比較，★P<0.05，★★P<0.01。組內(nèi)比較：與7 d比較，▲P<0.05；與14 d比較，☆P<0.05

3.3 補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對腦缺血后大鼠Bag-1蛋白表達(dá)的影響

正常腦組織中Bag-1蛋白為低水平表達(dá)，在腦缺血后表達(dá)水平逐漸增加。與A組比較，B組在7、14、28 d Bag-1蛋白表達(dá)上升不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C、D、E組在7、14、28 d Bag-1蛋白表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與B組比較，C、D、E組在7、14、28 d Bag-1蛋白表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與C組比較，D、E組在7、14、28 d Bag-1蛋白表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與D組比較，E組在7、14、28 d Bag-1蛋白表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。C、D、E組在7 d、14 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，腦缺血后E組對腦缺血后Bag-1蛋白表達(dá)的影響優(yōu)于D組，結(jié)果見表2，圖1～3。

表2 補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對大鼠腦缺血后Bag-1蛋白表達(dá)的影響個)

注：組間比較：與A組比較，△P<0.01；與B組比較，＊P<0.01 ；與C組比較，#P<0.05，##P<0.01；與D組比較，★P<0.05。組內(nèi)比較：與7 d比較，▲P<0.01 ；與14 d比較，☆P<0.01

圖1 補陽還五湯超微飲片與其傳統(tǒng)飲片對腦缺血后大鼠Bag-1蛋白表達(dá)的影響(術(shù)后7d)注：A：模型組；B：M+空白移植組；C：M+移植組；D：M+移植+補陽傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg組；E：M+移植+補陽超微飲片1.52 g/kg組

圖2 補陽還五湯超微飲片與其傳統(tǒng)飲片對腦缺血后大鼠Bag-1蛋白表達(dá)的影響(術(shù)后14 d)注：A：模型組；B：M+空白移植組；C：M+移植組；D：M+移植+補陽傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg組；E：M+移植+補陽超微飲片1.52 g/kg組

圖3 補陽還五湯超微飲片與其傳統(tǒng)飲片對腦缺血后大鼠Bag-1蛋白表達(dá)的影響(術(shù)后28 d)注：A：模型組；B：M+空白移植組；C：M+移植組；D：M+移植+補陽傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg組；E：M+移植+補陽超微飲片1.52 g/kg組

4 討論

大量實驗研究表明，正常成人腦組織中存在神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，是一種具有自我復(fù)制和定向分化潛能的細(xì)胞，一般以靜止、未增殖狀態(tài)存在于正常的生理環(huán)境中，當(dāng)腦組織受損時被激活[6]，并受其他因素的調(diào)控(如生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、周圍細(xì)胞等)。構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位主要是神經(jīng)元,定向誘導(dǎo)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[7]，而神經(jīng)干細(xì)胞在體外無限增殖，可促使神經(jīng)受損后神經(jīng)功能的恢復(fù)[8]。所以神經(jīng)干細(xì)胞移植將是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變或缺失疾病最有效的途徑之一。凋亡是一個多基因調(diào)控的過程，1995年Takaya ma[9]應(yīng)用重組人Bcl-2蛋白篩選胚胎c-DNA表達(dá)基因庫時發(fā)現(xiàn)的一種多功能結(jié)合蛋白—Bag-1基因，其是一種新型的、獨立的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[10]。具有獨立抗凋亡的作用，亦可與機體中Bcl-2受體結(jié)合，上調(diào)其功能，增強細(xì)胞抗凋亡能力[11]。

補陽還五湯出自王清任《醫(yī)林改錯》，為補氣活血經(jīng)方，方中重用黃芪大補元氣以治本，使氣能帥血，更用大量活血化瘀之品(當(dāng)歸、桃仁、紅花、赤芍、地龍等)生新以治標(biāo)，全方補氣活血化瘀，標(biāo)本兼顧。本研究團隊及國內(nèi)其他實驗室研究結(jié)果表明,補陽還五湯能促進(jìn)缺血后腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化[12]，可以阻斷細(xì)胞凋亡途徑，提高新生神經(jīng)元的成活率[13]，通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax、Caspase，減少缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡等凋亡因子的表達(dá)，這可能是其促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)機制之一[14]。本文所觀察的補陽還五湯超微飲片是導(dǎo)師多年的研究成果，相對于傳統(tǒng)飲片具有獨特的優(yōu)勢，可以增加溶出，方便吸收，提高生物利用度及藥材有效成分的溶出速率，同時也可以更大限度的保留生物活性成分。本實驗研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞能絕大多數(shù)被量子點標(biāo)記，正常腦內(nèi)存在一定量的Bag-1蛋白的表達(dá)，補陽還五湯能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，上調(diào)腦缺血損傷后Bag-1蛋白的表達(dá)，其量效關(guān)系體現(xiàn)在腦缺血后模型加移植加補陽還五湯超微飲片1.52 g/kg對腦缺血后大鼠Bag-1蛋白表達(dá)的影響作用優(yōu)于模型加移植加補陽還五湯傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg；提示補陽還五湯超微飲片的臨床用藥劑量可采用其傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量的1/3。

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