張洪財，陳雁雁，王文姌，付新

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥是一種以長期情緒低落為特征的精神類疾病。表現(xiàn)特征為睡眠困難、興趣喪失、食欲降低、情緒不穩(wěn)定,具有發(fā)病率高、致殘率高、治愈率低、復(fù)發(fā)率高的特點[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，抑郁癥在全球世界疾病負擔中排名第二。目前，臨床治療抑郁癥化學(xué)藥物主要有萬拉法辛、氟西汀、米氮平、舍曲林、艾司西酞普蘭、瑞博西丁。西藥特點為種類繁多、臨床應(yīng)用早、效果顯著,但是毒副作用較大，患者依從性差[3-4]。中醫(yī)藥治療抑郁癥療效較好，且毒副作用相對較小，成為眾多學(xué)者研究的焦點[5]。文獻報道柴胡、白芍、柴胡-白芍藥對均具有抗抑郁作用，且柴胡-白芍藥對是眾多方劑中經(jīng)典藥對。本課題組以CUMS抑郁大鼠模型為對象進行藥效學(xué)實驗，驗證其具有抗抑郁作用，但作用機制需進一步深入研究?；诖?，本實驗利用代謝組學(xué)技術(shù)研究CUMS抑郁大鼠血清代謝輪廓信息，尋找抑郁癥關(guān)聯(lián)的生物標志物，探索代謝途徑和作用靶點，闡述作用機制。

1 實驗儀器與材料

UPLC-Q-TOF/MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(美國Waters)；MassLynx 4.1質(zhì)譜軟件(美國Waters)；XZ-25K高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多)；TGL-16G低速離心機(上海安亭儀器有限公司)；KQ-300DE數(shù)控超聲清洗器(上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜HPLC級，迪馬科技)；色氨酸(65-46-3)、膽酸(81-25-4)、苯丙氨酸(89-18-7)對照品(上?？祈樕锟萍加邢薰?；溶血磷脂酰膽堿(190025)對照品(北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司)；尿酸(69-93-2)對照品(上海遠慕生物科技有限公司)；SCIENTZ-18ND型冷凍干燥機(寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司)。

健康SD大鼠，體質(zhì)量190～210 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCX2013-004，實驗動物使用許可證：SYK2013-012。

柴胡、白芍藥材購于哈爾濱世一堂中草藥專營店。

2 實驗方法

2.1 提取物的制備

按照柴胡、白芍藥材質(zhì)量1:1組成，水煎煮40 min，煎煮2次，合并水煎液，冷凍干燥，制成粉末備用。

2.2 模型的建立[6-8]

將禁食(24 h)、 夾尾(1 min)、間歇噪音刺激(85 dB)、電擊足底(電流強度10 mA，每隔1 min刺激1次，每次持續(xù)10 s，共30次)、斷水(24 h)、搖晃(1次/s，15 min)、45℃環(huán)境熱刺激(5 min)、晝夜顛倒(24 h)、4℃冷水游泳(5 min)，陌生氣味等10種應(yīng)激因子按隨機方法在28天內(nèi)應(yīng)用，為避免大鼠對刺激產(chǎn)生適應(yīng)性，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，每日給予1種刺激。每種刺激累計使用2～3次。

2.3 血清樣品的制備

造模3周后，正常組：正常飼養(yǎng)，不接受刺激，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg；模型組：每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg；藥對組：每日灌服藥對溶液4.5 ml/kg，生藥量5.9 g/(kg·d)，相當于70 kg體質(zhì)量成人臨床用藥的等效量，從實驗第一天到實驗結(jié)束，連續(xù)28天；氟西汀組：鹽酸氟西汀溶液4.5 ml/kg，生藥量1.8 mg/(kg·d )，相當于70 kg體質(zhì)量成人臨床用藥的等效量，從實驗第一天到實驗結(jié)束，連續(xù)28天。以上各組按程序給予不同應(yīng)激刺激，給藥治療4周后，采血前12 h禁食不禁水，眼眶采血，離心，樣品低溫(-70℃)保存，待測。

2.4 液相方法

AcquityTMUPLC液相色譜儀(四元梯度泵-在線真空脫氣機-自動進樣器-二極管陣列檢測器-柱溫箱)；ACQUITY UPLCTMHSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)色譜柱；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙睛；柱溫45℃；樣品倉溫度4℃；流速0.5 mL/min；進樣體積：2 μL。最佳梯度洗脫條件見表1。

表1 UPLC梯度洗脫方法

注：A:0.1%甲酸水；B:0.1%乙睛水

2.5 質(zhì)譜方法

電噴霧離子源(ESI；毛細管電壓2.5 kV；樣品錐孔電壓45 V；提取錐孔電壓4.0 V；脫溶劑氣溫度300℃；脫溶劑氣流量500 L/h；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters集團公司獨家專利Lockspray校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡膚(leueine-enkephalin,[M+H]-=556.277 1,[M-H]-=554.261 5)，鎖定質(zhì)量溶液濃度為200 pg/ml；質(zhì)量掃描范圍:數(shù)據(jù)平均超過10個掃描，掃描范圍m/z 50～900 Da，以centriod模式進行數(shù)據(jù)采集；工作站:Masslynx V4.1工作站。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠行為學(xué)指標

評價模型是否成功的指標是糖水偏愛率和攝食量。刺激6周后，模型組顯著低于空白組，說明模型建立成功。藥對組和氟西汀組優(yōu)于模型組，但與空白組比較無明顯差異。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠糖水偏愛率和攝食量實驗結(jié)果比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 血液樣品UPLC-HDMS分析方法的建立

建立了適合大鼠血液樣品的UPLC-HDMS分析方法，為全面、高效、準確地檢測大鼠血液中內(nèi)源性代謝物提供保證。色譜圖見圖1。

圖1 血液樣品典型UPLC-HDMS色譜圖

3.3 對血清代謝物譜的干預(yù)作用研究

采用非監(jiān)督主成分分析(PCA)方法，對空白組、模型組及給藥組大鼠血液的代謝指紋數(shù)據(jù)進行分析，繪制出反映組間離散程度的Score plot(圖2)。模型大鼠血液代謝物組發(fā)生了明顯的變化，與空白組相比明顯分類。模型大鼠給予柴胡-白芍藥對治療后，在Score plot上顯示出一個獨立的表征區(qū)域并且向空白組靠近，表明柴胡白芍藥對對模型大鼠代謝物組的變化具有回調(diào)作用。

圖2 大鼠血液代謝數(shù)據(jù)的PCA分析的Score plot圖和Loading-plot圖注：a:模型組；b:藥對組；c:空白組

3.4 代謝譜中生物標識物的鑒定

各組大鼠血清代謝物譜經(jīng)PCA處理，利用載荷矢量圖找到貢獻較大的代謝物，經(jīng)代謝物一、二級質(zhì)譜信息及對照品比對，共鑒定出5個對分類貢獻較大的代謝物。結(jié)果見表3。

表3 血清代謝物相關(guān)生物標志物

圖3 抑郁模型組與氟西汀組OPLS-DA圖注：S模型組；J：氟西汀組

圖4 抑郁模型組與藥對組OPLS-DA圖注：S模型組；Y：藥對組

4 討論

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說抑郁癥的病理機制之一。色氨酸含量決定5-羥色胺的合成，色氨酸的競爭性氨基酸是苯丙氨酸，柴胡-白芍藥對能明顯增加色氨酸的濃度，使苯丙氨酸濃度降低，5-羥色胺含量增加，改善抑郁狀態(tài)；膽酸是膽汁酸成分之一，能夠使脂類消化與吸收增強，參與肝腸循環(huán)，膽酸在血清中濃度增加，表明脂類物質(zhì)吸收與代謝出現(xiàn)異常情況[8]。藥對能夠降低膽酸濃度，調(diào)控脂類代謝起到治療效果；LPC與氧化應(yīng)激有關(guān)。模型組中血清飽和LPC濃度下降，不飽和LPC濃度含量增加，表明LCAT酶活性降低。且尿酸是非酶抗氧化劑，能清除過氧化物，清除自由基，藥對能夠提高尿酸濃度，抗氧化反應(yīng)，并能提高血清中飽和LPC濃度。

本實驗以抑郁癥模型大鼠為研究對象，用糖水偏愛率及攝食量兩個實驗指標作為模型成功標準。建立模型成功后，應(yīng)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析血清代謝譜，通過PCA主成分分析，發(fā)現(xiàn)血清中色氨酸、尿酸、膽酸、溶血磷脂酞膽堿發(fā)生明顯變化?；谝陨蟽?nèi)容，推測柴胡-白芍藥對抗抑郁機制可能是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，脂類代謝、神經(jīng)遞質(zhì)作用來實現(xiàn)的。

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