楊春梅，胡源霖，侯俊玲，3，王文全，3，4*，尚迪，施露

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100094；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；5.北京中醫(yī)藥大學東方學院，河北 廊坊 065001)

酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)是因長期飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。酒精可引起消化、循環(huán)、神經(jīng)等系統(tǒng)病變，其中肝臟作為酒精代謝的主要器官，受害最為常見[1-3]。ALD初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。中醫(yī)藥在防治酒精性肝病方面標本兼治，在早、中期，多以疏肝清熱、化痰利濕、活血祛瘀為主要治療原則，取得了一定的療效[4-5]。

SPG復(fù)方為本課題組研究方劑，主含丹參、赤芍、甘草等藥材，整方配伍體現(xiàn)活血化瘀、疏肝清熱、利肝止痛、扶正固本的治療思路，主要成分均有較多文獻報道對各種實驗性肝損傷具有改善作用[6-11]?；谇捌谂R床與文獻研究，本文以小鼠急性酒精性肝損傷為模型，考察SPG復(fù)方對小鼠急性酒精性肝損傷的影響及其口服給藥急性毒性,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物

ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄性，合格證號SYXK(京)2011-0024，購買自維通利華實驗動物有限公司。動物房保持通風，干燥，室溫22℃～25℃，濕度50%～70%，自由飲水，鼠料定量飼養(yǎng)。飼料由北京中醫(yī)藥大學西區(qū)實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑

SPG復(fù)方提取物按照本課題組前期研究結(jié)果[12]制備，浸膏中指標性成分丹酚酸B、芍藥苷及甘草酸轉(zhuǎn)移率分別為61.22%、84.63%、91.25%，分別配制成低、中、高三個劑量的供試液，按照1 ml/20 g體質(zhì)量灌胃給藥。為避免變質(zhì)，藥液均每日灌胃前臨用配制。

50%乙醇溶液：無水乙醇，配置成50%濃度(6 g/kg體質(zhì)量)灌胃;配制10%甲醛溶液；醫(yī)用生理鹽水。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)由自動生化檢測儀檢測；丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、谷胱甘肽(GSH)采用南京建成生物研究所試劑盒，嚴格按照說明書操作。

1.3 主要儀器

Sigma 3K15高速冷凍臺式離心機(德國賽唯斯科技(北京)有限公司)；SartoriusBP211D電子分析天平(德國賽多利斯集團)；FSH-2型高速勻漿機(江蘇常州國華公司)；QL-901渦旋混合器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；BP211D型電子分析天平 (精度：十萬分之一，瑞士METFLER- TOLEDO Co.)；XDTD-6000型恒溫水浴鍋(上海儀器儀表有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計軟件采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包分析,統(tǒng)計結(jié)果用(mean±SD)表示。組間比較先采用方差分析F檢驗進行方差齊性檢驗,方差齊的采用非配對t檢驗,不齊的采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方對小鼠急性酒精性肝損傷的影響

2.1.1 實驗設(shè)計與指標測定

60只小鼠隨機分為5組，分別為空白對照組、模型組、SPG復(fù)方低、中、高劑量組(0.975，1.95，3.9 g/kg)，每組12只。分組后，治療組均按照10 mL/kg灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，正常組和模型組每天灌胃等量的蒸餾水。末次給藥后，除正常對照組外，其余各組動物均按14 mL/kg灌胃50%乙醇，正常組灌胃相當劑量的蒸餾水。造模后禁食不禁水，12 h后摘眼球取血，分離血清，用自動生化分析儀測定血清中ALT、AST的活性。處死小鼠后，立即取肝臟右葉同一部位，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片和染色。另取肝臟200 mg，以零度生理鹽水清洗血液后制取肝組織勻漿，按照試劑盒操作說明測定并計算其中MDA、GSH、TG含量。

2.1.2 結(jié)果與分析

2.1.2.1 一般情況

小鼠在給藥期間無死亡，灌胃給予50%乙醇后出現(xiàn)翻正反射消失、嗜睡等醉酒狀態(tài)，約2～6 h逐漸蘇醒。

2.1.2.2 SPG復(fù)方對小鼠血清中ALT和AST活性的影響

小鼠血清ALT和AST活性統(tǒng)計結(jié)果見表1。與模型組相比，SPG高、中劑量組對血清ALT、AST水平的降低作用顯著(P<0.01、P<0.05)，低劑量組無差異。模型組與空白對照組在肝臟顏色、形態(tài)及血清ALT與AST活性方面的差異表明，小鼠一次暴飲50%乙醇的急性酒精性肝損傷模型成功，SPG水提物中、高劑量組可抑制肝損傷小鼠血清中ALT與AST活性的升高。

表1 各組血清ALT和AST活性比較

注：與空白對照組相比，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01

2.1.2.3 SPG復(fù)方對小鼠肝組織中GSH、MDA、TG含量的影響 見表2。

表2 各組肝組織勻漿中GSH、MDA、TG的含量對比

注：與空白對照組相比，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05

表2中各指標統(tǒng)計結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠肝組織勻漿中GSH水平顯著降低(P<0.01)，MDA與TG含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，SPG中、高劑量組對升高GSH水平、降低MDA水平有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組對兩指標均無顯著性影響；SPG高劑量組對降低TG水平有顯著性差異(P<0.05)，中、低劑量組對TG的含量沒有呈現(xiàn)出顯著的降低作用。

2.1.2.4 SPG復(fù)方對肝組織病理變化的影響

對酒精性肝損傷小鼠肝組織進行HE染色及組織形態(tài)學觀察，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝索呈放射狀排列清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠局部肝細胞變性，細胞核增大，肝血竇輕度擴張，中央靜脈結(jié)構(gòu)大致正常，肝細胞多邊形，體積輕度變小，細胞核略大小不一、染色質(zhì)深淺不等；SPG復(fù)方低劑量組肝細胞輕度變性，肝組織結(jié)構(gòu)基本完整；SPG復(fù)方中、高劑量組肝小葉排列整齊，肝索放射狀排列，肝血竇及中央靜脈結(jié)構(gòu)大致正常，肝細胞未見變性、壞死及炎細胞浸潤。

圖1 SPG復(fù)方對酒精性肝損傷小鼠肝組織的影響(HE染色，×40)注:1:正常對照組；2:模型對照組；3:SPG低劑量組；4:SPG中劑量組；5:SPG高劑量組

2.2 復(fù)方急性毒性實驗

2.2.1 實驗設(shè)計原理

急性毒性研究常用方法有近似致死劑量法、最大給藥量法(MLD)、上下法(階梯法)、最大耐受劑量(MTD)法、半數(shù)致死量法(LD50)等。前期預(yù)實驗以單位體積溶解或混懸最大濃度復(fù)方浸提物、并能通過小鼠灌胃12#針頭為準進行配液，得到最大給藥濃度為0.4 g/mL，并推算出日最大給藥劑量。參照毒性實驗方法[13]MTD和LD50無法測出，所以仍以MLD觀察小鼠在最大給藥濃度及給藥體積下的生理狀態(tài)，并依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進行設(shè)計[14]。

2.2.2 實驗分組

采用最大給藥量試驗法。選體質(zhì)量 18～22 g的ICR小鼠共50只， 雌雄各半。實驗共分3組，分別為正常對照組(10只小鼠，雌雄各半)、每日1次給藥組、每日2次給藥組，兩給藥組每組20只小鼠，雌雄各半。試驗前動物禁食16 h，不限飲水。兩個給藥組分別于第一天灌胃給予0.4 g/mL(相當于2 g生藥)的SPG復(fù)方水提物1次和2次，灌胃最大給藥容積為0.4 ml/(10 g·BW)；正常組灌胃給予相同體積量的蒸餾水。灌胃后觀察觀察14 d，每周稱重2次。

2.2.3 指標統(tǒng)計

灌胃后開始記錄小鼠行為活動、食物攝取、飲水、體質(zhì)量、外觀、分泌物、死亡情況等。試驗結(jié)束處死小鼠并進行大體解剖， 肉眼觀察肝、心、脾、肺、腎、胃、腸(大腸、小腸)的質(zhì)地、體積、顏色是否發(fā)生變化，如有死亡或解剖發(fā)現(xiàn)異常病變，則對改變的器官進行組織形態(tài)學檢查。

2.2.4 SPG復(fù)方急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

2.2.4.1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢正常

以最大給藥量的樣品給予小鼠灌胃后，未見動物有中毒癥狀，無動物死亡，試驗結(jié)束后通過脫頸處死動物并進行解剖，肉眼觀察未見心、肝、脾、肺、腎、胃、腸(大腸、小腸)有異常，體質(zhì)量變化趨勢符合小鼠基本生長規(guī)律，未出現(xiàn)體質(zhì)量明顯增加和減少的情況，結(jié)果見表3。從以上指標觀察認為，本復(fù)方對小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性級別基本無毒。

表3 小鼠體質(zhì)量變化表

2.2.4.2 復(fù)方水提物小鼠灌胃給藥MLD值

本次試驗結(jié)果表明，SPG復(fù)方浸提物以最大濃度、最大體積灌胃一次，觀察14日，未引起小鼠死亡，亦未影響其生長和行為活動，攝食、飲水、大小便及解剖學檢查等未發(fā)生異常。以最大濃度、最大體積灌胃給藥2次，在體質(zhì)量及生理活動狀態(tài)方面仍然未發(fā)現(xiàn)與正常組相比有異常的情況。按照最大給藥劑量0.4 g/mL(2 g生藥量)給藥量、最大給藥體積0.4 ml/(10 g·BW)，則小鼠實際給藥量為80 000 mg/(kg·BW)生藥材。此用藥劑量與臨床人用量相比，每日1次相當于人用量的228倍，每日給藥2次則相當于人用量的456倍。小鼠對SPG復(fù)方的每日最大給藥量按生藥材計MLD>160 g/kg。

3 討論

氧化應(yīng)激被認為是酒精性肝病的一個重要的致病因素[15]。機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶(ADH)的催化下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱，影響脂肪代謝，致α-磷酸甘油增多而促進甘油三酯(TG)合成。由肝細胞代謝產(chǎn)生乙醛并繼續(xù)代謝產(chǎn)生乙酸的過程同時產(chǎn)生了大量的還原型輔酶Ⅰ(NADH)，增加了呼吸鏈中傳遞的電子流，導(dǎo)致活性氧(ROS)過度產(chǎn)生[16-19]。乙醇通過激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基造成肝細胞膜的脂質(zhì)過氧化、體內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭，破壞肝細胞膜，引起肝內(nèi)脂肪沉積，引起肝臟和機體其他器官系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。

SPG復(fù)方中、高劑量組對肝損傷小鼠血清中ALT和AST的升高有顯著抑制作用，并可顯著升高GSH水平、降低MDA水平，高劑量組對TG的水平有顯著降低作用，病理特征與對照組相比有明顯改善，顯示了對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用。急毒結(jié)果說明,SPG復(fù)方口服劑量低毒安全，為進一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。復(fù)方的保肝效果可能與其抗氧化作用有關(guān)，機制有待進一步研究。

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