竇建衛(wèi)，尚榮國，彭湃，黃芊，朱宇紅*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710004)

陽和湯由熟地黃、甘草、麻黃、白芥子等中藥組成，具有溫陽散寒、補(bǔ)血通滯之效。前期研究表明，陽和湯對乳腺癌細(xì)胞內(nèi)多種信號通路蛋白可起到抑制作用，對乳腺癌具有良好的控制作用，且藥物安全性良好[1-3]。課題組前期對陽和湯中的肉桂、麻黃、白芥子、土貝母進(jìn)行了質(zhì)量控制研究，為了進(jìn)一步控制其質(zhì)量，我們分別采用薄層色譜法和高效液相色譜法對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究,內(nèi)容如下。

1 儀器與設(shè)備

1.1 儀器

超聲波清洗機(jī)(型號：PS-40，深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司)；分析天平(型號：YP1201N，上海天平儀器廠)；0.1 mg微量分析天平(型號：FA1104，上海天平儀器廠)；0.01 mg微量分析天平(型號：AB135-S，梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

芥子堿硫氰酸鹽對照品(批號111702-201605)；甘草對照藥材(批號120904-201519)；毛蕊花糖苷對照品(批號111530-201512)；供試品、陰性樣品均為自制；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 熟地黃

取樣品適量(約5 mL)，加入一定量甲醇溶液(約50 mL)，超聲0.5 h，濾過，收集甲醇相并蒸干，得殘?jiān)?，再加水溶? mL溶解，加正丁醇萃取分離(3次)，每次用量10 mL，合并有機(jī)相，蒸干，得殘?jiān)?，再加甲醇溶? mL溶解，為供試品溶液[4]。同時(shí)，取一定量毛蕊花糖苷對照品，甲醇溶解，配制對照品溶液。按照處方的構(gòu)成比，取不含熟地黃的其余藥材，用同樣的方法制成不含該成分的陰性樣品溶液。依薄層色譜法(通則0502)[5]，取以上溶液各10 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板的同一水平線上，將其放入展開劑中片刻，拿出，晾干后，浸漬于0.1%的2,2-二苯基-1-苦胼基無水乙醇溶液中，取出晾干。展開劑按照乙酸乙酯-甲醇-甲酸試液體積比為17∶1∶2配制而成。結(jié)果顯示，供試品與對照品色譜相比在相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)顯相同形狀、顏色，隨行陰性顯示無干擾，因此將此方法列入標(biāo)準(zhǔn)正文。

2.2 甘草

取適量樣品(約5 mL)，加甲醇溶液約40 mL，加熱回流1.5 h，過濾，收集有機(jī)相并蒸干，得殘?jiān)偌铀芤?0 mL溶解，加正丁醇萃取分離(3次)，每次用量10 mL，合并有機(jī)相，蒸干，得殘?jiān)偌蛹状既芤? mL溶解，為供試品溶液[6]。同時(shí)將甘草對照藥材，按以上方法配制成對照品溶液。按處方的構(gòu)成比，取不含甘草的其余藥材，用同樣的方法制成不含甘草的陰性樣品溶液。取以上溶液各5 μL,各自點(diǎn)到硅膠G薄層板的同一水平線上，放入展開劑中片刻，拿出后，晾干，將10%硫酸乙醇噴于薄層板上,105℃條件下加熱，斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)時(shí)停止。展開劑按照醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水體積比為14∶1∶1∶2配制而成。供試品與對照品色譜相比，在相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)顯相同形狀、顏色，隨行陰性顯示無干擾，因此將此方法列入標(biāo)準(zhǔn)正文。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(14∶86)；檢測波長326 nm。按芥子堿峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)≥3 000。

3.2 對照品溶液的制備

取一定量芥子堿硫氰酸鹽，用甲醇溶液配制成濃度為150 μg/mL的溶液，為對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精確量取樣品10 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲處理1.5 h，稍冷，補(bǔ)加甲醇溶液至刻度線，混勻，過濾，收集續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備

按3.3制備方法，取除白芥子外的陰性樣品適量，制備陰性對照溶液。

3.5 干擾性試驗(yàn)

精確量取對照品溶液10 μL，進(jìn)行檢測，獲得色譜圖，供試品和陰性對照溶液重復(fù)上述步驟。結(jié)果可知，在色譜峰相對應(yīng)的位置上，陰性樣品無色譜峰被檢出，說明制劑中其他藥材不會干擾芥子堿硫氰酸鹽的測定。結(jié)果如圖1～3。

圖1 芥子堿硫氰酸鹽對照品HPLC圖

圖2 樣品HPLC圖

圖3 陰性對照樣品HPLC圖

3.6 線性考察

稱取一定量芥子堿硫氰酸鹽對照品，用甲醇溶液作為溶劑，制備為濃度為41.0、60.0、82.0、205.0、410.0 μg/mL的溶液，定量吸取上述溶液20 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得色譜圖及峰面積積分值，分析得到其回歸方程：y=1 693.3x-86.614(r=0.999 2)，在0.82～8.2 μg范圍內(nèi)，芥子堿硫氰酸鹽與峰面積有較好的線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(色譜條件如上)，獲得色譜圖，色譜峰面積，以芥子堿硫氰酸鹽峰面積進(jìn)行考察，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD等于0.75%。結(jié)果可知，該方法精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在0 h開始，每隔2 h進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣5次，每次10 μL，獲得色譜圖，同時(shí)測定色譜峰面積，RSD等于0.72%。結(jié)果可知，在8 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

按以上方法制備供試品溶液6樣份，順次分別取10 μL進(jìn)行分析，獲得色譜圖，計(jì)算其中芥子堿硫氰酸鹽的含量為0.436 mg/mL，RSD=0.98%。結(jié)果可知，此種方法有很好的重復(fù)性。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取一定量已知濃度的樣品，各1 mL，依次分別加入容量瓶中，分別加以上芥子堿硫氰酸鹽(濃度：0.415 mg/mL)對照品溶液1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL，依以上方法制備、分析，獲得色譜圖，計(jì)算樣品中芥子堿硫氰酸鹽含量、回收率，結(jié)果見表1。

表1 樣品的回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.11 樣品的含量測定

按以上方法對3批陽和湯進(jìn)行含量測定，芥子堿硫氰酸鹽平均含量為0.445 mg/mL。

4 討論

陽和湯作為臨床常用中藥復(fù)方制劑，由熟地黃、甘草、麻黃、白芥子等組成。其中熟地黃為滋養(yǎng)之品，滋陰補(bǔ)腎，養(yǎng)血調(diào)肝；麻黃、肉桂、炮姜炭、白芥子乃溫陽之藥，具有驅(qū)散寒邪，腠理開，寒凝解，氣血則行，毒跡隨消。肉桂、炮姜炭入血分，溫經(jīng)散結(jié)而解寒凝；麻黃辛溫，得熟地黃而通絡(luò)[7]；白芥子通陽散寒而消痰結(jié)，祛內(nèi)外之痰。諸藥配伍，針對陽氣虧虛之本，寒凝痰滯之標(biāo)，溫陽共補(bǔ)陰合用，滋膩和辛散相伍，溫且不燥、補(bǔ)而不膩。寒邪易客于肌肉、筋骨，凝則為痰，凝痰阻礙氣血運(yùn)行，日久為瘀血，寒痰瘀聚于乳，則為“乳巖”，本方溫陽化寒痰而解凝聚，血得陽氣而行，寒痰得陽氣而消，則痰瘀腫塊之乳巖可除。

前期研究表明，在體外作用方面，陽和湯可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，下調(diào)NF-κB 的表達(dá)、減少IL-8的分泌，從而有效阻止乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[2]；在體內(nèi)作用方面，陽和湯可通過降低血清中IL-6、腫瘤組織中MMP-9，以及降低組織中CD90的表達(dá)，顯著抑制裸鼠移植瘤的生長、增殖及轉(zhuǎn)移[1,3]。臨床觀察表明，陽和湯能有效控制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，具有較高的安全性。因此為了進(jìn)一步控制陽和湯的質(zhì)量，更好的應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)研究，我們建立了陽和湯中芥子堿硫氰酸鹽的含量測定方法。此外，我們對其中熟地黃、甘草進(jìn)行薄層色譜鑒別研究，在相應(yīng)展開系統(tǒng)下的供試品色譜中，能特征性地鑒別出制劑中熟地黃、甘草，以便有效地控制陽和湯的質(zhì)量，更好的應(yīng)用于臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 竇建衛(wèi),任翠翠,郝云,等.陽和湯對裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響及其抑瘤作用[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(3):391-393.

[2] 竇建衛(wèi),黃芊,趙天一,等.陽和湯對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞NF-κB、IL-8表達(dá)的影響[J].四川中醫(yī),2017,35(2):44-47.

[3] 竇建衛(wèi),黃芊,趙天一,等.陽和湯對三陰性乳腺癌裸鼠移植瘤生長及IL-6、MMP-9表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2016,18(12):1-4.

[4] 陳遙,汪翔,汪濤,等.玉女煎顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥師,2014,17(9):1460-1463.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].四部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:57-59．

[6] 王芳,王四旺,姚敏娜,等.菊藤膠囊制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].西北藥學(xué)雜志,2017,32(4):416-420.

[7] 竇建衛(wèi),郝云,楊亦奇,等.陽和湯治療乳腺癌理論發(fā)微[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(2):196-198.