李佳賓，丁常宏，張爽，郭慧，崔紅花，王振月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

內(nèi)生真菌是指植物在其生命周期的各個時段體內(nèi)所包含的定植在宿主活體組織中并且不使宿主產(chǎn)生任何病癥的真菌[1]。植物界中的所有植物幾乎都含有內(nèi)生真菌。在相互作用的漫長過程中，內(nèi)生真菌與植物形成共生關(guān)系，植物為真菌供應生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌產(chǎn)生植物激素增進植物生長和組織分化，還可以通過制造營養(yǎng)素和與病原菌競爭來保護植物[2]。近些年來，有許多學者對內(nèi)生真菌的促生作用進行了研究。Abdur Rahim Khan等[3]研究了龍葵內(nèi)生真菌培養(yǎng)液對其生長的影響，顯著提高了其生物量;陳貝貝等[4]發(fā)現(xiàn)一株促進地黃生長的內(nèi)生真菌;劉慧等[5]的研究也證明內(nèi)生真菌對宿主生長有較大影響。毛脈酸模為蓼科酸模屬多年生草本植物，在民間以根入藥，對淋病、上呼吸道感染、癬病和瘡毒有確切療效[6]，其根中含有酸模素、大黃酚、大黃素、白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、大黃素甲醚等多種有效成分[7]，具有重要的應用和研究價值。本實驗研究內(nèi)生真菌對毛脈酸模的作用，獲得有促生作用的內(nèi)生真菌，為毛脈酸模栽培技術(shù)的研究提供參考，為內(nèi)生真菌的應用與開發(fā)提供借鑒。

1 材料

毛脈酸模種子，取自黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園。毛脈酸模內(nèi)生真菌，由丁常宏博士分離獲得。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L；無菌苗培養(yǎng)基：MS，蔗糖30 g，瓊脂9 g，水1 L，pH值6；共生培養(yǎng)基：同無菌苗培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

將內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上進行活化，28℃暗培養(yǎng)一周。

2.2 毛脈酸模無菌苗的制備

參考謝彥梅等[8]的方法，對種子進行處理，接種種子于無菌苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度(晝/夜)25/18℃、光照周期14/10 h、光強3 000 Lx的條件下培養(yǎng)，至種苗長出3片真葉。

2.3 共生培養(yǎng)

選取長勢一致的無菌苗接種至含有共生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種一株，5天后挑取內(nèi)生真菌菌絲接種在距離無菌苗2 cm處，3個重復，置于培養(yǎng)溫度(晝/夜)25℃/18℃、光照周期14/10 h、光強3 000 Lx的條件下培養(yǎng)25天。

2.4 篩選促進毛脈酸模生長的共生體系

共培養(yǎng)結(jié)束后，觀察植株形態(tài)，區(qū)分出促進生長的共培養(yǎng)體系，抑制生長的共培養(yǎng)體系和無明顯作用的共培養(yǎng)體系。

2.5 植物生理指標測定

從有促進作用的共培養(yǎng)體系中將苗從培養(yǎng)皿中取出，小心洗去附著在根部的培養(yǎng)基和菌絲，吸干水分后，測量株高，稱量鮮重，烘干至恒重后，稱量干重。

2.6 促生長內(nèi)生真菌的鑒定

根據(jù)培養(yǎng)基菌落特征和內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)特征，參照文獻[9-10]進行形態(tài)鑒定，確定到屬。

3 結(jié)果與分析

3.1 促進毛脈酸模生長的內(nèi)生真菌

內(nèi)生真菌與毛脈酸模無菌苗共培養(yǎng)之后，有5個菌株(G-A、G-C、G-D、J-B、J-G)具有促生長作用，葉片寬大肥厚，見圖1；2株內(nèi)生真菌對種苗沒有明顯的促進和抑制(Y-B，Y-A-1)，見圖2；10株內(nèi)生真菌對毛脈酸模有不同程度的抑制作用，植物表現(xiàn)出一定的致病性，枯萎、矮小、黃化等(G-B、Y-E、J-3、J-A、J-C、J-F、Y-2、Y-A-2、Y-C、Y-D)，見圖3。

圖1 內(nèi)生真菌促進毛脈酸模生長的共生組和對照組

圖2 內(nèi)生真菌無明顯促進和抑制作用的共生組和對照組

圖3 內(nèi)生真菌抑制毛脈酸模生長的共生組和對照組

值得注意的是Y-A-2、J-A、J-3這3株菌在共生的前期種苗生長狀態(tài)優(yōu)于對照組，共生時間超過20天后出現(xiàn)葉片枯萎、植株矮小的狀況。這說明植物和內(nèi)生真菌的關(guān)系并非一成不變的，隨著環(huán)境的變化，有益的共生可能轉(zhuǎn)變?yōu)橛泻Φ募纳?/p>

具有促生作用的內(nèi)生真菌有5株，接種這5種內(nèi)生真菌的毛脈酸模種苗的生長指標見表1，對株高，地上鮮重、干重，根部鮮重、干重有不同程度的正面影響。單因素方差分析表明，與對照相比，5個菌株均能增加毛脈酸模的株高，其中J-G菌株能顯著增加株高，比對照提高了21.9%。在根鮮重方面，5個菌株對毛脈酸模根鮮重都有提高，其中G-A、J-G、G-D、G-C的促進作用均達顯著水平，分別比對照增加了134.3%，173.0%，271.3%，156.2%。在根干重方面，G-A和G-C可以顯著增加根的干重，分別增加139.9%和116.7%，其余菌株對毛脈酸模干重也有不同程度的增加。對地上部分的干重和鮮重，5個菌株對毛脈酸模均有促進作用，但未達到顯著水平。

接種不同的菌株對毛脈酸模的影響也不一樣，G-A對測定的5個指標均有正面影響，在根鮮重和干重方面達到顯著水平。J-G對株高和根鮮重的影響顯著，J-B對毛脈酸模各方面均有提高，但并不顯著。G-D對株高和根的鮮重和干重均有促進作用，對根鮮重促進作用顯著，但對地上部分的鮮重和干重幾乎沒有影響。G-C作用與G-A相似都顯著增加了根的鮮重和干重，對其他方面有促進作用但并不顯著。

毛脈酸模的根是其主要藥用部位，所以菌株G-A和G-C對根部生長的促進作用具有重要的意義。

表1 內(nèi)生真菌對毛脈酸模的促生作用

注：與CK比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 促生長內(nèi)生真菌的鑒定

經(jīng)菌落形態(tài)和顯微觀察，參照文獻[9-10]鑒定得出，5株內(nèi)生真菌分屬于3目，4科，5屬。結(jié)果見表2。

表2 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

4 討論

本實驗從分離的17種內(nèi)生真菌中篩選出5種具有不同促生作用的內(nèi)生真菌，分析了其促生作用，并對其種屬進行了鑒定，這5種內(nèi)生真菌分別來自于絲核孢屬、小尾孢屬、齒痕霉屬、長蠕孢屬、木霉屬。這與胡鳳[11]等對毛脈酸模內(nèi)生真菌的分離結(jié)果相似。G-A、G-C、G-D都分離自毛脈酸?；铙w植株的根部，J-B、J-G分離自毛脈酸模的莖，毛脈酸模內(nèi)生真菌的促生作用可能是其侵入植物體后與之形成菌根結(jié)構(gòu)[12]，或者內(nèi)生真菌產(chǎn)生了促進植物生長的次生代謝物[13]。部分菌種在與植株共生過程中出現(xiàn)前后促生效果不一致的現(xiàn)象，因為兩者之間的相互作用關(guān)系發(fā)生了改變，互惠共生是植物的防衛(wèi)反應和內(nèi)生菌的營養(yǎng)需求間的復雜的平衡，營養(yǎng)物交換的不平衡是大多數(shù)共生到寄生轉(zhuǎn)變的特點[2]。隨著真菌的生長，大量在植物體內(nèi)定植，營養(yǎng)需求增多，對幼苗的生長造成太大壓力，兩者之間的平衡被打破，出現(xiàn)由共生到寄生的轉(zhuǎn)變。不同的內(nèi)生真菌對宿主的促生作用不同，促進植物生長的部位和程度也不同，侯小強[14]等就篩選出8株對鐵皮石斛有不同促生作用的內(nèi)生真菌。根據(jù)不同內(nèi)生真菌的不同促生效果，可以對其進行分類利用。從藥用部位方面來說，促進毛脈酸模根部生長的內(nèi)生真菌具有較大價值。

本實驗只對毛脈酸模生物量進行了測定，植物內(nèi)部理化性質(zhì)的改變尚不明確，我們將在隨后的工作中對此進行相關(guān)研究。

因為很難模擬植物體內(nèi)環(huán)境，所以植物的內(nèi)生真菌難以全部分離[15]，因此，毛脈酸模植物體內(nèi)可能存在著許多未知的具有促生作用的內(nèi)生真菌。這些內(nèi)生真菌可以縮短毛脈酸模生長周期，增加毛脈酸模中藥資源，具有重要實用價值。所以，對于內(nèi)生真菌促進植物生長的特性的研究和共生技術(shù)的獲得具有重要的意義。

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