李佳賓，丁常宏，張爽，郭慧，崔紅花，王振月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

內(nèi)生真菌是指植物在其生命周期的各個(gè)時(shí)段體內(nèi)所包含的定植在宿主活體組織中并且不使宿主產(chǎn)生任何病癥的真菌[1]。植物界中的所有植物幾乎都含有內(nèi)生真菌。在相互作用的漫長(zhǎng)過(guò)程中，內(nèi)生真菌與植物形成共生關(guān)系，植物為真菌供應(yīng)生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌產(chǎn)生植物激素增進(jìn)植物生長(zhǎng)和組織分化，還可以通過(guò)制造營(yíng)養(yǎng)素和與病原菌競(jìng)爭(zhēng)來(lái)保護(hù)植物[2]。近些年來(lái)，有許多學(xué)者對(duì)內(nèi)生真菌的促生作用進(jìn)行了研究。Abdur Rahim Khan等[3]研究了龍葵內(nèi)生真菌培養(yǎng)液對(duì)其生長(zhǎng)的影響，顯著提高了其生物量;陳貝貝等[4]發(fā)現(xiàn)一株促進(jìn)地黃生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌;劉慧等[5]的研究也證明內(nèi)生真菌對(duì)宿主生長(zhǎng)有較大影響。毛脈酸模為蓼科酸模屬多年生草本植物，在民間以根入藥，對(duì)淋病、上呼吸道感染、癬病和瘡毒有確切療效[6]，其根中含有酸模素、大黃酚、大黃素、白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、大黃素甲醚等多種有效成分[7]，具有重要的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)毛脈酸模的作用，獲得有促生作用的內(nèi)生真菌，為毛脈酸模栽培技術(shù)的研究提供參考，為內(nèi)生真菌的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料

毛脈酸模種子，取自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園。毛脈酸模內(nèi)生真菌，由丁常宏博士分離獲得。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L；無(wú)菌苗培養(yǎng)基：MS，蔗糖30 g，瓊脂9 g，水1 L，pH值6；共生培養(yǎng)基：同無(wú)菌苗培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

將內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，28℃暗培養(yǎng)一周。

2.2 毛脈酸模無(wú)菌苗的制備

參考謝彥梅等[8]的方法，對(duì)種子進(jìn)行處理，接種種子于無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度(晝/夜)25/18℃、光照周期14/10 h、光強(qiáng)3 000 Lx的條件下培養(yǎng)，至種苗長(zhǎng)出3片真葉。

2.3 共生培養(yǎng)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌苗接種至含有共生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種一株，5天后挑取內(nèi)生真菌菌絲接種在距離無(wú)菌苗2 cm處，3個(gè)重復(fù)，置于培養(yǎng)溫度(晝/夜)25℃/18℃、光照周期14/10 h、光強(qiáng)3 000 Lx的條件下培養(yǎng)25天。

2.4 篩選促進(jìn)毛脈酸模生長(zhǎng)的共生體系

共培養(yǎng)結(jié)束后，觀察植株形態(tài)，區(qū)分出促進(jìn)生長(zhǎng)的共培養(yǎng)體系，抑制生長(zhǎng)的共培養(yǎng)體系和無(wú)明顯作用的共培養(yǎng)體系。

2.5 植物生理指標(biāo)測(cè)定

從有促進(jìn)作用的共培養(yǎng)體系中將苗從培養(yǎng)皿中取出，小心洗去附著在根部的培養(yǎng)基和菌絲，吸干水分后，測(cè)量株高，稱(chēng)量鮮重，烘干至恒重后，稱(chēng)量干重。

2.6 促生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的鑒定

根據(jù)培養(yǎng)基菌落特征和內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)特征，參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行形態(tài)鑒定，確定到屬。

3 結(jié)果與分析

3.1 促進(jìn)毛脈酸模生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌

內(nèi)生真菌與毛脈酸模無(wú)菌苗共培養(yǎng)之后，有5個(gè)菌株(G-A、G-C、G-D、J-B、J-G)具有促生長(zhǎng)作用，葉片寬大肥厚，見(jiàn)圖1；2株內(nèi)生真菌對(duì)種苗沒(méi)有明顯的促進(jìn)和抑制(Y-B，Y-A-1)，見(jiàn)圖2；10株內(nèi)生真菌對(duì)毛脈酸模有不同程度的抑制作用，植物表現(xiàn)出一定的致病性，枯萎、矮小、黃化等(G-B、Y-E、J-3、J-A、J-C、J-F、Y-2、Y-A-2、Y-C、Y-D)，見(jiàn)圖3。

圖1 內(nèi)生真菌促進(jìn)毛脈酸模生長(zhǎng)的共生組和對(duì)照組

圖2 內(nèi)生真菌無(wú)明顯促進(jìn)和抑制作用的共生組和對(duì)照組

圖3 內(nèi)生真菌抑制毛脈酸模生長(zhǎng)的共生組和對(duì)照組

值得注意的是Y-A-2、J-A、J-3這3株菌在共生的前期種苗生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組，共生時(shí)間超過(guò)20天后出現(xiàn)葉片枯萎、植株矮小的狀況。這說(shuō)明植物和內(nèi)生真菌的關(guān)系并非一成不變的，隨著環(huán)境的變化，有益的共生可能轉(zhuǎn)變?yōu)橛泻Φ募纳?/p>

具有促生作用的內(nèi)生真菌有5株，接種這5種內(nèi)生真菌的毛脈酸模種苗的生長(zhǎng)指標(biāo)見(jiàn)表1，對(duì)株高，地上鮮重、干重，根部鮮重、干重有不同程度的正面影響。單因素方差分析表明，與對(duì)照相比，5個(gè)菌株均能增加毛脈酸模的株高，其中J-G菌株能顯著增加株高，比對(duì)照提高了21.9%。在根鮮重方面，5個(gè)菌株對(duì)毛脈酸模根鮮重都有提高，其中G-A、J-G、G-D、G-C的促進(jìn)作用均達(dá)顯著水平，分別比對(duì)照增加了134.3%，173.0%，271.3%，156.2%。在根干重方面，G-A和G-C可以顯著增加根的干重，分別增加139.9%和116.7%，其余菌株對(duì)毛脈酸模干重也有不同程度的增加。對(duì)地上部分的干重和鮮重，5個(gè)菌株對(duì)毛脈酸模均有促進(jìn)作用，但未達(dá)到顯著水平。

接種不同的菌株對(duì)毛脈酸模的影響也不一樣，G-A對(duì)測(cè)定的5個(gè)指標(biāo)均有正面影響，在根鮮重和干重方面達(dá)到顯著水平。J-G對(duì)株高和根鮮重的影響顯著，J-B對(duì)毛脈酸模各方面均有提高，但并不顯著。G-D對(duì)株高和根的鮮重和干重均有促進(jìn)作用，對(duì)根鮮重促進(jìn)作用顯著，但對(duì)地上部分的鮮重和干重幾乎沒(méi)有影響。G-C作用與G-A相似都顯著增加了根的鮮重和干重，對(duì)其他方面有促進(jìn)作用但并不顯著。

毛脈酸模的根是其主要藥用部位，所以菌株G-A和G-C對(duì)根部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用具有重要的意義。

表1 內(nèi)生真菌對(duì)毛脈酸模的促生作用

注：與CK比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 促生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的鑒定

經(jīng)菌落形態(tài)和顯微觀察，參照文獻(xiàn)[9-10]鑒定得出，5株內(nèi)生真菌分屬于3目，4科，5屬。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從分離的17種內(nèi)生真菌中篩選出5種具有不同促生作用的內(nèi)生真菌，分析了其促生作用，并對(duì)其種屬進(jìn)行了鑒定，這5種內(nèi)生真菌分別來(lái)自于絲核孢屬、小尾孢屬、齒痕霉屬、長(zhǎng)蠕孢屬、木霉屬。這與胡鳳[11]等對(duì)毛脈酸模內(nèi)生真菌的分離結(jié)果相似。G-A、G-C、G-D都分離自毛脈酸?；铙w植株的根部，J-B、J-G分離自毛脈酸模的莖，毛脈酸模內(nèi)生真菌的促生作用可能是其侵入植物體后與之形成菌根結(jié)構(gòu)[12]，或者內(nèi)生真菌產(chǎn)生了促進(jìn)植物生長(zhǎng)的次生代謝物[13]。部分菌種在與植株共生過(guò)程中出現(xiàn)前后促生效果不一致的現(xiàn)象，因?yàn)閮烧咧g的相互作用關(guān)系發(fā)生了改變，互惠共生是植物的防衛(wèi)反應(yīng)和內(nèi)生菌的營(yíng)養(yǎng)需求間的復(fù)雜的平衡，營(yíng)養(yǎng)物交換的不平衡是大多數(shù)共生到寄生轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)[2]。隨著真菌的生長(zhǎng)，大量在植物體內(nèi)定植，營(yíng)養(yǎng)需求增多，對(duì)幼苗的生長(zhǎng)造成太大壓力，兩者之間的平衡被打破，出現(xiàn)由共生到寄生的轉(zhuǎn)變。不同的內(nèi)生真菌對(duì)宿主的促生作用不同，促進(jìn)植物生長(zhǎng)的部位和程度也不同，侯小強(qiáng)[14]等就篩選出8株對(duì)鐵皮石斛有不同促生作用的內(nèi)生真菌。根據(jù)不同內(nèi)生真菌的不同促生效果，可以對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)利用。從藥用部位方面來(lái)說(shuō)，促進(jìn)毛脈酸模根部生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌具有較大價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)只對(duì)毛脈酸模生物量進(jìn)行了測(cè)定，植物內(nèi)部理化性質(zhì)的改變尚不明確，我們將在隨后的工作中對(duì)此進(jìn)行相關(guān)研究。

因?yàn)楹茈y模擬植物體內(nèi)環(huán)境，所以植物的內(nèi)生真菌難以全部分離[15]，因此，毛脈酸模植物體內(nèi)可能存在著許多未知的具有促生作用的內(nèi)生真菌。這些內(nèi)生真菌可以縮短毛脈酸模生長(zhǎng)周期，增加毛脈酸模中藥資源，具有重要實(shí)用價(jià)值。所以，對(duì)于內(nèi)生真菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性的研究和共生技術(shù)的獲得具有重要的意義。

[1] Hua Wei Zhang,Yong Chun Song,Ren Xiang Tan.Biology and chemistry of endophytes[J].Nat Prod Rep,2006,23,753-771.

[2] Karl-Heinz Kogel,Philipp Franken and Ralph Hückelhoven.Endophyte or parasite-what decides?[J].Current Opinion in Plant Biology,2006,9:358-363.

[3] Abdur Rahim Khan,Ihsan Ullah,Muhammad Waqas,et al.Plant growth-promoting potential of endophytic fungi isolated from Solanum nigrum leaves[J].World J Microbiol Biotechnol,2015(31):1461-1466.

[4] 陳貝貝,王敏,胡鳶雷,等.地黃內(nèi)生真菌促生作用的初步研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(9):1137-1140.

[5] 劉慧,陳薇,周勇,等.內(nèi)生真菌和叢枝菌根真菌對(duì)羊草生長(zhǎng)的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2015,39(5):477-485.

[6] 吉林省中醫(yī)中藥研究所.長(zhǎng)白山植物藥志[M].長(zhǎng)春:吉林人民出版社,1982:299.

[7] 王振月,李瑞明,王宗權(quán),等.土壤養(yǎng)分與毛脈酸模根中生物活性成分含量之間的相關(guān)性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2007,32(19):1984-1987.

[8] 謝彥梅,許巖,常豐華,等.毛脈酸模無(wú)菌苗的制備及下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(2):98-100.

[9] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.

[10] HL巴尼特,BB享特.半知菌屬圖解[M].沈崇堯,譯.北京:科學(xué)出版社,1977.

[11] 胡鳳,侯素云,高寧,等.毛脈酸模內(nèi)生真菌分布特征及其優(yōu)勢(shì)菌群化學(xué)成分相似度分析[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2012,28(4):387-391.

[12] 田蜜,陳應(yīng)龍,李敏,等.叢枝菌根結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2013,24(8):2369-2376.

[13] Muhammad Waqas,Abdul Latif Khan,Muhammad Kamran,et al.Endophytic Fungi Produce Gibberellins and Indoleacetic Acid and Promotes Host-Plant Growth during Stress[J].Molecules,2012,17(9):10754-10773.

[14] 侯曉強(qiáng),郭順星.鐵皮石斛促生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的篩選與鑒定[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(17):3232-3237.

[15] 文才藝,吳元華,田秀玲.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問(wèn)題[J].生態(tài)學(xué)雜志,2004,23(2):86-91.