王娟紅 ，臧 明 ，鄭毛亮 ，常衛(wèi)華

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木兵團畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.河南省武陟縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，武陟 454950）

母羊胎產(chǎn)羔數(shù)和發(fā)情次數(shù)是衡量綿羊高產(chǎn)的兩個重要指標(biāo)。綿羊常年發(fā)情或季節(jié)性發(fā)情是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，除激素外，一些主效基因或蛋白對其也起到關(guān)鍵的作用。近年來，隨著分子生物技術(shù)的高速發(fā)展，有關(guān)綿羊發(fā)情的分子方面的研究也越來越深入，綿羊的發(fā)情研究已從最初對少量主效基因的研究發(fā)展到轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)水平上的研究［1-6］。本文對近年來利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)對綿羊繁殖調(diào)控方面的研究作一總結(jié)和分析，為同行提供一定參考。

1 綿羊重要繁殖特性基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進展

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptome）是指在某一生理條件下，機體細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括小RNA（small RNAs，sRNA）、信使 RNA（mRNA）及一小部分基因間區(qū)和基因區(qū)的非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）。目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)有：表達序列標(biāo)簽、DNA微陣列技術(shù)、基因表達序列分析以及全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序。2005年以來，新一代高通量測序技術(shù)相繼誕生，包括Illumina/Solexa測序、ABI/SOLiD和 Roche/454測序等，這些高新技術(shù)為主效基因的挖掘及功能研究提供了更為廣闊的平臺。

朱廣琴［7］通過SSH技術(shù)構(gòu)建文庫的方法從奶山羊發(fā)情期卵巢中篩選出DCN、OAZ1、EPHX1和FSHR基因，實時定量PCR及生物信息學(xué)分析證實這些卵巢內(nèi)基因均與母羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。有研究利用RNA-seq技術(shù)獲得了小尾寒羊不同繁殖狀態(tài)下的基因表達模式，提出TGF-β信號通路中FSTL3、SMAD1、SMAD4和TGFBRII基因及胰島素信號通路中的BAD基因可能對常年發(fā)情有一定的調(diào)控作用。研究證實，卵巢卵泡液含有高濃度的褪黑素，而且在顆粒細胞內(nèi)有褪黑素受體的表達，對卵巢功能具有一定的調(diào)控作用［8-10］。Di等［11］通過高通量測序技術(shù)對發(fā)情季節(jié)的灘羊和小尾寒羊卵巢進行了miRNA研究，鑒別出183條不同miRNA家族的483條miRNA，在乏情期其中25個表達差異顯著，對發(fā)情具有重要的調(diào)控作用。Shi等［12］對濟寧青山羊卵巢研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α和β、孕酮受體mRNA的表達具時空特異性，該差異性與繁殖特點有關(guān)。Aungier等［13］研究證實，GnRH調(diào)控著E2濃度的增加與發(fā)情活動之間的關(guān)系，E2波峰后隨濃度增加，仍有90%以上動物保持發(fā)情行為。Ling等［14］研究指出，F(xiàn)ER1L4、SRD5A2基因在安徽白山羊和布爾羊不同組織中表達模式不同，推測該基因可能與安徽白山羊的多胎性有關(guān)。Chang等［15］利用高通量測序技術(shù)對甘肅高山細毛羊黃體期卵巢小RNA進行了研究，獲得9321775條cleanreads和267條候選miRNA，研究證實候選miRNA Ovis_aries_ovary-m0033_3p 為卵巢特異性 miRNA。Miao 等［16］通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了不同品種綿羊mRNA與miRNA的表達水平，其研究結(jié)果有助于鑒別繁殖調(diào)控相關(guān)候選基因。Abadjieva 等［17］研究證實，GDF9 和 BMP15 在卵巢和顆粒細胞內(nèi)表達，而且蒺藜皂甙可以改變GDF9和BMP15在兔子卵巢和F1雌性后代中的表達模式。Chang等［18］研究指出，BMPs/GDFs是卵泡形成及卵巢功能的重要因子，調(diào)控生殖疾病及不育等通路信號。Yang等［19］研究指出，非發(fā)情季節(jié)在生殖內(nèi)分泌及卵巢生理系統(tǒng)中PLA2G4D能直接調(diào)控卵泡發(fā)育，間接影響瘦素的分泌。Yang 等［20］研究表明，chemerin/GPR1 信號通路在卵泡發(fā)育、黃體形成和黃體溶解中直接或間接調(diào)控孕激素的合成及分泌。黃冬維等［21］研究發(fā)現(xiàn)，2型脫碘酶基因（type Ⅱiodothyronine deiodinase gene，DIO2）和3型脫碘酶基因（type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）與羊的季節(jié)性發(fā)情調(diào)控有關(guān)，而且DIO3基因可能負調(diào)控發(fā)情活動。付紹印等［22］通過比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活性的配體－受體相互作用信號通路在下丘腦－垂體－卵巢性腺軸調(diào)控排卵及卵泡發(fā)育方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，篩選了影響產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)基因，豐富和補充了綿羊基因組信息。

從文獻報道來看，卵巢上的一些關(guān)鍵基因?qū)β殉不顒蛹肮δ艿陌l(fā)揮起著非常重要的作用，而通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以篩選到一些調(diào)控的關(guān)鍵基因［23-25］，尤其是在多浪羊常年發(fā)情主效基因的篩選上意義重大。

2 綿羊重要繁殖特性調(diào)控蛋白組學(xué)研究進展

Wilkins和Williams于1994年第一次提出蛋白質(zhì)組（proteome）這一概念，但直到1995年7月，蛋白質(zhì)組這一概念才在《Electrophoresis》雜志上出現(xiàn)，當(dāng)時對蛋白質(zhì)組概念定義為基因組所表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式［26］。經(jīng)過二十幾年的發(fā)展，現(xiàn)在的研究學(xué)者普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)組是一個基因組、一種生物、一種細胞或一種組織所表達的全部蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代的一門新興學(xué)科，指基因組在某個細胞或某種組織中表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式，目的是從蛋白質(zhì)層面揭示生物體的生理本質(zhì)和生命活動規(guī)律，重點在于對蛋白質(zhì)進行定量研究。而定量研究主要分為2個方面，一是基于凝膠技術(shù)的研究方法（如2-DE和2D-DIGE技術(shù)）和基于質(zhì)譜技術(shù)的研究（如iTRAQ/SILAC、Label free和SRM/MRM）。其中同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ，isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是一種新的、功能強大的相對和絕對定量研究的方法，由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）開發(fā)，該技術(shù)具有高精確性、高效率，而且重復(fù)性好，可以在一次串聯(lián)質(zhì)譜實驗中同時比較4個、多可達8個樣品中蛋白的相對含量。

Hamelin等［27］以比利時特塞爾綿羊品種為研究對象，調(diào)查了數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）引起的綿羊肌肉肥大是否對肌漿蛋白的表達產(chǎn)生影響，研究發(fā)現(xiàn)，只有α抗胰蛋白酶（Alpha-1-antitrypsin）在4種類型的肌肉中表達水平相似。預(yù)測這些蛋白可作為綿羊肌肉肥大的標(biāo)志性蛋白，同時對研究正常肌肉的發(fā)育機制具有重要意義。Jia等［28］以綿羊卵巢組織為研究對象，建立了卵巢蛋白雙向凝膠電泳（2-DE）最佳體系，對卵巢蛋白提取與處理、樣品上樣量以及等點聚焦電壓、時間等條件做了優(yōu)化，為其他動物卵巢組織的處理及2-DE提供了參考。Soleilhavoup等［29］報道，在黃體期，大量蛋白如血漿銅藍蛋白、乳鐵蛋白，DMBT1及PIGR與免疫系統(tǒng)有關(guān)，CD9和腓骨蛋白均與組織重構(gòu)有關(guān)，而且myosin 9和纖維連接蛋白在發(fā)情期和黃體表面明顯不同。2016年陳瀟飛［30］利用iTRAQ蛋白表達譜共篩選到綿羊角蛋白2 356個，其中置信區(qū)間蛋白1 345個。正常兩角與畸形角組共137個差異表達蛋白，正常多角與畸形角組共91個差異表達蛋白，兩角與多角組共66個差異表達蛋白。正常角與畸形角組的差異蛋白主要富集在細胞外基質(zhì)、組織發(fā)育、細胞外基質(zhì)分解代謝和膠原蛋白代謝等過程；兩角與多角組主要富集在細胞分泌和細胞外基質(zhì)分泌等過程。同時利用Western Blotting和Q-PCR分別對iTRAQ結(jié)果進行驗證，結(jié)果表明，使用蛋白表達譜iTRAQ技術(shù)篩選綿羊相關(guān)差異蛋白具有可靠性及準(zhǔn)確性。Miao等［31］通過iTRAQ技術(shù)分析了小尾寒羊和無角陶賽特母羊卵巢蛋白，鑒別了上萬個差異蛋白，GO和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白與氧化還原酶、細胞色素C氧化酶及載體等活性有關(guān)，該研究結(jié)果為小尾寒羊高繁殖力分子調(diào)控機理的理解提供基礎(chǔ)。

可見，通過蛋白組學(xué)技術(shù)對綿羊重要繁殖調(diào)控細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)組成、表達水平、修飾情況以及蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系等進行系統(tǒng)的分析，可以篩選到部分關(guān)鍵候選蛋白，而這些蛋白在綿羊重要繁殖性狀及組織功能的發(fā)揮方面具有非常重要的作用，將在轉(zhuǎn)錄后揭示蛋白質(zhì)與綿羊繁殖調(diào)控活動的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律，為研究多浪羊等綿羊常年發(fā)情的繁殖機理提供基礎(chǔ)。

3 轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)的關(guān)聯(lián)分析

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體最基礎(chǔ)、最主要的一種調(diào)控方式，在動物正常生長發(fā)育、抗病、組織器官功能的發(fā)揮及應(yīng)激反應(yīng)等過程中，細胞、組織等主效基因表達模式會發(fā)生顯著變化。與基因組等其他組學(xué)相比，轉(zhuǎn)錄組研究的是機體某一組織或細胞中表達的全部RNA，包括mRNA、小RNA及小部分非編碼RNA等，直接反映了組織或細胞主效基因表達模式的變化水平，而且轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果不含內(nèi)含子，測序數(shù)據(jù)分析方便。轉(zhuǎn)錄組學(xué)為研究機體內(nèi)組織或細胞基因表達及調(diào)控提供了重要的技術(shù)和方法，同時也為主效基因或功能基因的挖掘提供了重要途徑，是連接蛋白質(zhì)組生物功能和基因組遺傳信息的紐帶［32］。相比而言，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)相對較少，而且需要相應(yīng)轉(zhuǎn)錄組信息給予驗證。目前，蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果的精確度及準(zhǔn)確度比轉(zhuǎn)錄組要低一到兩個數(shù)量級，組織或細胞內(nèi)表達豐度比較低的一些蛋白現(xiàn)有技術(shù)無法檢測到；而且目前獲得的大部分轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)相關(guān)性比較差。因此，需要將二者的研究結(jié)果或數(shù)據(jù)相互關(guān)聯(lián)，以進一步揭示功能基因或主效基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。Chalmel等［33］論述了在精子形成過程中，蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的關(guān)聯(lián)性及利用RNA-seq高通量測序轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和MS-based蛋白組學(xué)技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)新的蛋白編碼基因及新的蛋白亞型的表達。

對轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析獲得的差異基因和同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)篩選的差異蛋白進行二者關(guān)聯(lián)性分析，當(dāng)組織或細胞內(nèi)某個蛋白被鑒定到而且在轉(zhuǎn)錄組水平上有表達信息時，被認(rèn)為關(guān)聯(lián)到，然后分析二者之間的相關(guān)性；通過對多浪羊繁殖及調(diào)控組織進行蛋白質(zhì)定量及其關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄本作關(guān)聯(lián)聚類分析及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，獲得調(diào)控多浪羊常年發(fā)情的主效基因。目前，雖然轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的比較多，但是二者之間的關(guān)聯(lián)性分析仍然很少，尤其是對新疆特有品種——多浪羊常年發(fā)情的調(diào)控機理研究尚屬首次。

4 總結(jié)和展望

基因和蛋白質(zhì)如何通過相互作用而調(diào)控相應(yīng)生理活動，仍然是生物學(xué)家目前研究的熱點問題。綿羊發(fā)情調(diào)控是個錯綜復(fù)雜的過程，并且受到一些主效基因的調(diào)控，而且這種調(diào)控作用研究非常少，隨著科學(xué)技術(shù)的進展并通過逐步研究，相關(guān)的外部主要調(diào)控靶點及調(diào)控機理將會逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法發(fā)展非常迅速，相應(yīng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而蛋白組學(xué)仍處在不斷的成長、發(fā)展及完善階段，對于生物樣品中低拷貝的蛋白質(zhì)目前仍舊無法擴增。隨著高端儀器及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，獲得的不同物種、不同組織器官的蛋白組數(shù)據(jù)也越來越多。而且，由于諸如同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）新型蛋白定量技術(shù)的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)的量化精確度也越來越高。轉(zhuǎn)錄后修飾技術(shù)如磷酸化研究發(fā)展迅猛，而且蛋白糖基修飾技術(shù)近幾年也發(fā)展迅猛，但這些技術(shù)方法由于專業(yè)性強，對人員要求高，因此，應(yīng)用明顯受到限制，相對于透徹的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析其科研成果還遠遠不夠。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)之間的互補及驗證，二者的聯(lián)合分析在多浪羊等綿羊常年發(fā)情領(lǐng)域主效基因的挖掘及功能研究的應(yīng)用方面會越來越廣泛，再結(jié)合內(nèi)分泌研究，其常年發(fā)情的分子調(diào)控機制將愈來愈清晰。

［1］Reiter R J.The pineal and its hormones in the control of reproduction in mammals［J］.Endocr Rev，1980，1（2）：109-131.

［2］Revel F G，Ansel L，Klosen P.Kisspeptin：a key link to seasonal breeding［J］.Rev Endocr Metab Disord，2007，8（1）：57-65.

［3］Greives T J，Mason A O，Scotti M A.Environmental control of kisspeptin：implications for seasonal reproduction［J］.Endocrinology，2007，148（3）：1158-1166.

［4］張英杰，劉月琴，儲明星.小尾寒羊高繁殖力和常年發(fā)情內(nèi)分泌機理的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2001，32（6）：510-516.

［5］Malpaus B，Tricoire H，Mailliet F.Melatonin and seasonal reproduction：understanding the neuroendocrine mechanisms using the sheep as a model［J］.Reprod Suppl，2002，59：167-179.

［6］Fabre-nys C，Kendrick K M，Scaramuzzi R J.The “ram effect”：new insights into neural modulation of the gonadotropic axis by male odors and socio-sexual interactions［J］.Frontiers in Neuroscienc，2015.

［7］朱廣琴.多羔和單羔奶山羊發(fā)情期卵巢組織差異表達基因的篩選、鑒定及分析［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

［8］Barros V R，Cavalcante A Y，Macedo T J.Immunolocalization of melatonin and follicle-stimulating hormone receptors in caprine ovaries and their effects during in vitro development of isolated preantral follicles［J］.Reproduction in Domestic Animals，2013，48：1025-1033.

［9］Manca M E，Manunta M L，Spezzigu A.Melatonin deprival modifies follicular and corpus luteal growth dynamics in a sheep model［J］.Reproduction，2014，147（6）：885-895.

［10］Wang S J，Liu W J，We C J.Melatonin suppresses apoptosis and stimulates progesterone production by bovine granulosa cells via its receptors（MT1 and MT2）［J］.Theriogenology，2012，78：1517-1526.

［11］Di R，He J，Song S.Characterization and comparative profiling of ovarian microRNAs during ovine anestrus and the breeding season［J］.BMC Genomics，2014，15：899.

［12］Shi Y，Wang S，Bai S.Postnatal ovarian development and its relationship with steroid hormone receptors in Jining grey goats［J］.Anim Reprod Sci，2015，154：39-47.

［13］Aungier S P，Roche J F，Duffy P.The relationship between activity clusters detected by an automatic activity monitor and endocrine changes during the periestrous period in lactating dairy cows［J］.J Dairy Sci，2015，98（3）：1666-1684.

［14］Ling Y，Quan Q，Xiang H.Expression profiles of differentially expressed genes affecting fecundity in goat ovarian tissues［J］.Genetics and Molecular Research，2015，14（4）：18743-18752.

［15］Chang W H，Wang J H，He J Z.Identification of a novel miRNA from the ovine ovary by a combinatorial approach of bioinformatics and experiments［J］.The Journal of Veterinary Medical Science，2015，77（12）：1617-1624.

［16］Miao X ，Qin Q L.Genome-wide transcriptome analysis of mRNAs and microRNAs in Dorset and Small-tail han sheep to explore the regulation of fecundity ［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2015，402（15）：32-42.

［17］Abadjieva D，Kistanova E.Tribulus terrestris alters the expression of growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 in rabbit ovaries of mothers and F1female offspring ［J］.PLoS One，2016，11（2）：1-17.

［18］Chang H M，Qiao J，Leung P C.Oocyte-somatic cell interactions in the human ovary-novel role of bone morphogenetic proteins and growth differentiation factors［J］.Hum Reprod Update，2016，23（1）：1-18.

［19］Yang H，Lin S，Lei X.Identification and profiling of microRNAs from ovary of estrous Kazakh sheep induced by nutritional status in the anestrous season ［J］.Animal Reproduction Science，2016，175：18-26.

［20］Yang Y L，Ren L R，Sun L F.The role of GPR1 signaling in mice corpus luteum［J］.Journal of Endocrinology，2016，230：55-65.

［21］黃冬維，劉秋月，儲明星.山羊繁殖季節(jié)性相關(guān)基因DIO2與DIO3 的表達分析 ［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2016，24（10）：1536-1543.

［22］付紹印，何小龍，王標(biāo)，等.不同產(chǎn)羔數(shù)綿羊性腺軸比較轉(zhuǎn)錄組研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（2）：488-496.

［23］Mitelman F，Johansson B，Mertens F.The impact of translocation and gene fusions on cancer causation［J］.Nat Rev Cancer，2007，7（4）：233-245.

［24］Wang E T，Sandberg R，Luo S［J］.Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes［J］.Nature，2008，456（7221）：470-476.

［25］Trapnell C，Williams B A，Pertea G.Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation ［J］.Nat Biotechnol，2010，28（5）：511-515.

［26］Van-wijk K J.Challenges and prospects of plant proteomics［J］.Plant Physiol，2001，126（2）：501-504.

［27］Hamelin M，Sayd T，Chambon C.Proteomic analysis of ovine muscle hypertrophy［J］.J Anim Sci，2006，84（12）：3266-3276.

［28］Jia J L，Zhang L P，Wu J P.Establishment of the optimum two-dimensional electrophoresis system of ovine ovarian tissue ［J］.Genet Mol Res，2014，13（3）：6528-6538.

［29］Soleilhavoup C，Riau C，Tsikls G.Proteomes of the female genital tract during the oestrous cycle［J］.Molecular&Cellular Proteomics，2016，15（1）：93-108.

［30］陳瀟飛.利用蛋白表達譜iTRAQ技術(shù)篩選與綿羊角遺傳調(diào)控相關(guān)的候選蛋白［D］.昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［31］Miao X，Luo Q，Zhao H.Ovarian proteomic study reveals the possible molecular mechanism for hyperprolificacy of Small-tail han sheep［J］.Scientific Reports，2016，6：27606.

［32］Suzuki Y，Sugano S.Transcriptome analyses of human genes and applications for proteome analyses［J］.Curr Protein Pept Sci，2006，7（2）：147-163.

［33］Chalmel F，Rolland A D.Linking transcriptomics and proteomics in spermatogenesis［J］.Reproduction，2015，150（5）：149-157.