楊軍祥

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所 744000）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成員廣泛分布于脊椎動(dòng)物體內(nèi)[1]，在調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用，該家族成員主要包括TGF-β抑制素、TGF-β活化素等。

肌肉生長(zhǎng)抑制素 （myostatin，MSTN）在1997年被美國科學(xué)家McPherron首次發(fā)現(xiàn)，屬于生長(zhǎng)分化因子β超家族成員。MSTN是近年來發(fā)現(xiàn)具有負(fù)向調(diào)控作用的因子，該基因的突變可使MSTN活性降低或者喪失，從而促使骨骼肌更好地生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn) “雙肌臀”。目前，研究人員已經(jīng)根據(jù)該基因培育出了經(jīng)濟(jì)效益佳的肉畜品種，如作為終端父本的 “雙肌臀”肉牛，在生產(chǎn)中產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，具有瘦肉率高、飼料報(bào)酬好和生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)。

中國是世界上山羊存欄量最多的國家，也是世界上最大羊肉生產(chǎn)國。山羊以天然草料為主食，其肉質(zhì)好、蛋白含量豐富、能量低，富含多種氨基酸和微量元素，且膽固醇含量低。畜產(chǎn)品瘦肉率的提高和肉品質(zhì)的改善有利于優(yōu)化人們的膳食結(jié)構(gòu)，尋找與畜禽生長(zhǎng)性狀和肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因或遺傳標(biāo)記，對(duì)品種改良具有重要意義。本文從山羊MSTN基因的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、功能及作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展入手，探尋MSTN基因與山羊生長(zhǎng)性能及經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系，為甘肅本地山羊種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)和利用開辟新的途徑。

1 MSTN基因的結(jié)構(gòu)

MSTN基因的cDNA（complementary DNA）是由1個(gè)可讀框和能編碼376個(gè)氨基酸的脫氧核糖核苷酸堿基序列構(gòu)成，其中外顯子3個(gè)、內(nèi)含子2個(gè)，而成熟區(qū)是其第3外顯子。MSTN基因具有TGF-β超家族成員的典型結(jié)構(gòu)特征，即由52ku的前體蛋白質(zhì)N-末端區(qū)和編碼12.5ku成熟肽的C-末端區(qū)構(gòu)成[2]，在N-末端區(qū)與C-末端區(qū)之間存在1個(gè)蛋白酶解加工位點(diǎn)，經(jīng)過2次蛋白酶解加工，除去信號(hào)多肽，切除前體蛋白質(zhì)生成N-端前肽與C-端多肽，而C-端多肽又以—S—S—(二硫鍵)鍵相連形成二聚體，構(gòu)成MSTN成熟蛋白分泌至血液循環(huán)，并與N-端前肽以非共價(jià)鍵形式形成LAP。

除以上所述之外，MSTN基因與TGF-β超家族成員還有下面4個(gè)共同點(diǎn)：（1）在信號(hào)肽的N-末端區(qū)附近有一個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的疏水前體蛋白質(zhì)核心； （2）MSTN蛋白質(zhì)靠C-末端區(qū)的中間部位有一個(gè)保守的蛋白酶解加工信號(hào) （RSSR，263-266位氨基酸）； （3）9個(gè)半胱氨酸殘基在C-末端區(qū)形成 “Cys Knot”結(jié)構(gòu)； （4）分子之間的二硫鍵均能聚合形成二聚體，并和細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，通過3種Sand蛋白介導(dǎo)，將信號(hào)傳入細(xì)胞，作用于靶基因的調(diào)控區(qū)。

Thomas等利用MSTN特異性抗體，在牛成肌細(xì)胞培養(yǎng)物的提取液中檢測(cè)到52ku的前體蛋白質(zhì)、40ku的LAP，但沒有檢測(cè)到加工后的活性蛋白，這可能是因?yàn)槌墒斓幕钚缘鞍妆环置诘窖旱木壒蔥3]。但在骨骼肌提取物中檢測(cè)到26ku的活性蛋白。而McPherron等則報(bào)道在CHO細(xì)胞表達(dá)的重組MSTN前體蛋白和成熟的活性蛋白分別為52和12ku，這種分子質(zhì)量的差異可能是由于翻譯后修飾造成的[2]。

Gonzalez-Cadavid等證實(shí)，人的MSTN基因也由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，位于染色體2q33.2，含有3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為3.1kb的mRNA，編碼375個(gè)氨基酸的前體蛋白[4]。Ma等克隆了人MSTN基因包括5′端調(diào)控區(qū)在內(nèi)的全長(zhǎng)3.3kb片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSTN啟動(dòng)子序列含有對(duì)多種物質(zhì)的生長(zhǎng)反應(yīng)元件，這些物質(zhì)包括糖皮質(zhì)激素、肌生長(zhǎng)分化因子1、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2、核因子-B等，并發(fā)現(xiàn)在體外，地塞米松以一種劑量依賴的方式不僅可增強(qiáng)MSTN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性且可增強(qiáng)內(nèi)源性MSTN基因的表達(dá)[5]。

2 MSTN基因的生物學(xué)功能

MSTN基因的功能主要體現(xiàn)在抑制肌肉增肌和脂肪積累兩個(gè)方面，其具體的生物學(xué)功能包括以下幾個(gè)方面。

（1）MSTN基因?qū)∪獾纳L(zhǎng)起負(fù)向調(diào)控作用即抑制肌肉生長(zhǎng)。Mcpherron利用基因敲除技術(shù)證明了MSTN基因突變后的小鼠肌肉重量增大[2]。目前已有學(xué)者研究證實(shí)，牛MSTN基因可以改變肌肉的組織構(gòu)造，把MSTN基因鈍化，使骨骼和皮下脂肪間的肌肉相互抑制作用減弱 (即骨骼肌的激增)，因?yàn)槲闯墒斓慕K止密碼子和蛋白的無功能表達(dá)引起1個(gè)多肽的平截，使MSTN基因不能被表達(dá)為功能蛋白質(zhì)，從而出現(xiàn)臀部、胸及其中前端肌肉異常發(fā)達(dá)，且皮膚較薄的 “雙肌臀現(xiàn)象”。

（2）MSTN基因與肌肉再生有一定的關(guān)系。Wagner等利用MSTN基因完全突變的小鼠與肌肉萎縮型小鼠雜交發(fā)現(xiàn)，MSTN基因完全缺失的肌肉萎縮型小鼠與非缺失的萎縮性小相比更為強(qiáng)壯、肌肉更多，肌肉間的隔膜表現(xiàn)出更少的纖維樣變形，這表明MSTN基因缺失對(duì)肌肉再生有促進(jìn)作用[6]。Taylor等用重組MSTN基因?qū)κ蠊趋兰2C12細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，重組MSTN蛋白在C2C12肌細(xì)胞中能抑制或阻礙細(xì)胞的增生、DNA合成和蛋白質(zhì)合成，證明MSTN基因可能通過抑制肌肉的再生控制肌肉的生長(zhǎng)[7]。

（3）MSTN基因能使肌肉萎縮。Gilson等通過研究人慢性廢用性肌肉萎縮中MSTN基因mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)病人的MSTN基因mRNA表達(dá)水平比正常人顯著高，同時(shí)其表達(dá)量與2A、2B型纖維量成反比，因此，得出MSTN基因是促使肌肉萎縮的因子[8]。

（4）MSTN基因抑制脂肪沉積。Zimmers等研究發(fā)現(xiàn)，給裸鼠腿部注射能穩(wěn)定表達(dá)MSTN的CHO細(xì)胞后，裸鼠全身骨骼肌出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，體內(nèi)的白色脂肪也差不多完全消失，說明MSTN基因不僅能抑制肌肉的生長(zhǎng)，還能參于體內(nèi)脂肪的代謝，抑制脂肪積累，這在生產(chǎn)中有利于提高瘦肉率[9]。

3 MSTN基因多態(tài)性的研究進(jìn)展

目前的研究結(jié)果表明，MSTN基因的功能在不同動(dòng)物間高度保守。Lee將小鼠MSTN的保守C-末端編碼序列作為探針，對(duì)小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞、斑馬魚的MSTN cDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)，各種動(dòng)物的MSTN基因序列高度保守，其N-末端都有分泌必需的信號(hào)肽序列，都有類胰蛋白酶作用水解加工位點(diǎn) (RSRR)，都含有TGF-β超家族的富含半胱氨酸的保守區(qū)，且小鼠、大鼠、人、豬、雞、火雞的水解加工位點(diǎn)后的C-末端序列完全一致，同源性為100%，而牛、綿羊的成熟蛋白中也僅有l(wèi)～3個(gè)。

劉錚鑄等采用限制性內(nèi)切酸酶Mnl I對(duì)山羊MSTN基因的379bp的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP多態(tài)性分析，證實(shí)山羊內(nèi)含子2、外顯子3區(qū)域存在多態(tài)性[10]。孟詳人等利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)11個(gè)綿羊品種MSTN基因非編碼區(qū)進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)存在3種基因型CC型、CT型和TT型，且3種基因型在11個(gè)綿羊品種中的分布差異極顯著 （＜0.01）[11]。劉錚鑄等采用PCR和直接測(cè)序的方法對(duì)我國9個(gè)地方綿羊品種和1個(gè)引入品種共計(jì)60個(gè)個(gè)體進(jìn)行MSTN基因內(nèi)含子2和外顯子3的多態(tài)性檢測(cè)及單倍型分析，共發(fā)現(xiàn)15SNPs，全部存在于內(nèi)含子2中，同時(shí)檢測(cè)到12種單倍型，并推測(cè)單倍型VIII可能與綿羊的產(chǎn)肉性能有關(guān)[12]。朱紅剛等采用PCR-RFLP方法對(duì)67只貴州小香羊MSTN基因內(nèi)含子2和外顯子3進(jìn)行了多態(tài)性分析[13]。結(jié)果表明，所擴(kuò)增內(nèi)含子2中存在Bsp1286I的酶切多態(tài)位點(diǎn)，共檢測(cè)到3種基因型AA型、AB型、BB型，其中AB為優(yōu)勢(shì)基因型；所擴(kuò)增內(nèi)含子2和外顯子3中存在BstBI酶切多態(tài)位點(diǎn)，雜合型 （CD）為優(yōu)勢(shì)基因型，純合野生型 （CC）和純合突變型 （DD）為非優(yōu)勢(shì)基因型，D等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因。

由此可見，山羊的MSTN基因與其他動(dòng)物MSTN基因相似，具有一定程度的保守型，其多態(tài)性主要集中在內(nèi)含子2和外顯子3區(qū)域，該基因?qū)τ诩倚蠹∪獾纳L(zhǎng)影響較大。

4 MSTN基因調(diào)控機(jī)制的研究

MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)負(fù)調(diào)控的作用機(jī)制至今尚未完全清楚，目前的研究結(jié)果認(rèn)為，其作用機(jī)制有以下途徑。

根據(jù)TGF-β超家族成員信號(hào)傳導(dǎo)途徑，推測(cè)MSTN基因抑制肌肉生長(zhǎng)的作用機(jī)理：MSTN基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中需要Ⅰ型 （TβRⅠ）和Ⅱ型 （TβRⅡ）受體的異二聚體復(fù)合物。MSTN基因C-端的半胱氨酸二聚體首先與TβRⅡ型受體結(jié)合，然后再與TβRⅠ型受體結(jié)合，于細(xì)胞表面處形成異源聚合體，通過TβRⅡ型受體激酶的活性，導(dǎo)致TβRⅠ型受體CT區(qū)域發(fā)生磷酸化，活化的TβRⅠ型受體可暫時(shí)與胞漿內(nèi)Smads家族中的Smad2、Smad3結(jié)合，并激活C-端SSXS區(qū)域使絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化。最后與無磷酸位點(diǎn)Smads家族中的Smad4形成異源聚合物，進(jìn)入細(xì)胞核中，導(dǎo)致生肌調(diào)節(jié)因子MyoD磷酸化過程受阻，阻止了與E-box位點(diǎn)的結(jié)合，這個(gè)E-box位點(diǎn)是其堿性區(qū)域和位于成肌細(xì)胞調(diào)控區(qū)內(nèi)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，干擾有活性MyoD-E-box形成特定的肌肉蛋白質(zhì)，從而抑制成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞分化，阻礙肌肉的形成。

5 MSTN基因在甘肅本地山羊種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用上的前景

隴東黑山羊是甘肅省優(yōu)良的地方山羊品種，具有抗逆性強(qiáng)（耐寒、耐旱），肉質(zhì)優(yōu)良 （羊肉鮮嫩，膻味輕，口感佳），適應(yīng)性好 （耐粗放管理、耐粗飼）等優(yōu)點(diǎn)。隴東白絨山羊是以隴東黑山羊?yàn)槟副?，引進(jìn)遼寧絨山羊和內(nèi)蒙古白絨山羊做父本，經(jīng)過長(zhǎng)期的雜交選擇培育而成的以絨用為主的山羊品種。近年來，由于盲目引種和放任本交，使得隴東黑山羊和隴東白絨山羊的血統(tǒng)混雜、生產(chǎn)性能嚴(yán)重退化，純種飼養(yǎng)量下降，甚至處于瀕危狀態(tài)，種質(zhì)資源保護(hù)迫在眉睫。為了保護(hù)、開發(fā)、利用這些優(yōu)良的地方品種，基層畜牧工作者和科研人員進(jìn)行不懈的努力，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的普及、地方畜牧從業(yè)者理論技術(shù)的提升和基礎(chǔ)條件的改善，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行優(yōu)勢(shì)基因發(fā)掘和種質(zhì)資源保護(hù)也提上了日程。

MSTN基因是調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的重要功能基因，也是重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因，具有廣闊的應(yīng)用前景，其多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)系等已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。因此，在隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)、利用上，可以利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，研究其純種個(gè)體及其與布爾山羊等優(yōu)秀肉用山羊雜交后代MSTN基因的多態(tài)性和生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)肉性能之間的關(guān)系，分析其群體遺傳結(jié)構(gòu)，并確定其對(duì)羔羊體重、體尺及屠宰性能的影響，確定最佳雜交改良方案。同時(shí)，篩選出MSTN基因突變的個(gè)體，通過培育選擇出產(chǎn)肉率高、肉品質(zhì)好和飼料報(bào)酬率高的優(yōu)秀個(gè)體作為種畜進(jìn)行推廣，深度發(fā)掘地方優(yōu)良品種潛力，為隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)、利用工作開辟新的途徑。