陳 彬 詹 學(xué)

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400014

早在十九世紀(jì)中晚期，德國(guó)科學(xué)家在觀(guān)察人體胃組織切片的過(guò)程中就發(fā)現(xiàn)了螺旋菌，即后來(lái)的幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，HP），因無(wú)法體外培養(yǎng)，它一直沒(méi)有受到人們的重視，直到1982年才被兩位澳大利亞科學(xué)家巴里·馬歇爾（Barry J.Marshall）和羅賓·沃倫（J. Robin Warren）首次成功在體外分離培養(yǎng)。由于它與胃炎、胃潰瘍和胃癌的密切關(guān)系[1]，人們?cè)絹?lái)越需要對(duì)HP的生物特性進(jìn)行研究，從而指導(dǎo)臨床診療工作，那么，如何改進(jìn)已有的培養(yǎng)方式，使得HP的體外培養(yǎng)更加方便、快捷、高效就成為了一個(gè)亟需解決的問(wèn)題，所以，從那以后人們一直在不斷探索HP的最優(yōu)體外培養(yǎng)條件。至今，各種體外培養(yǎng)方法已經(jīng)得到了不同程度的優(yōu)化。幾個(gè)關(guān)鍵的培養(yǎng)條件為全血或血清、微氧及適宜的CO2氣體環(huán)境，高濕度，溫度37℃，pH值7.5以及4～10d的發(fā)酵周期[2]。

1 固體培養(yǎng)基

1.1 菌株的制備和保存

目前培養(yǎng)用的幽門(mén)螺桿菌的來(lái)源主要有兩個(gè)：一是在非選擇性培養(yǎng)基上，通過(guò)病理活檢組織培養(yǎng)獲得HP。常用的非選擇性培養(yǎng)基常為腦心浸液瓊脂，其組成為：腦心浸潤(rùn)液，瓊脂，5%脫纖維羊或牛血清。這種方式優(yōu)點(diǎn)是成本低且易操作；缺點(diǎn)：一是得到的菌株可能不純，且由于培養(yǎng)條件的限制，每次得到的菌株數(shù)量有限。同時(shí)，有報(bào)道稱(chēng)實(shí)驗(yàn)室用布魯氏肉湯培養(yǎng)基對(duì)HP感染患者的血清培養(yǎng)獲得了較好的HP菌株[3]。二是直接向生物公司購(gòu)買(mǎi)，這種方式優(yōu)點(diǎn)是方便、快捷，而且得到的菌株較純，缺點(diǎn)是成本高，大量需要菌株時(shí)不宜采用。

當(dāng)用上述方式成功由活檢組織中分離得到HP菌液后，我們需要將其進(jìn)行保存，常用冷凍保存法，綜合眾多文獻(xiàn)報(bào)道，保存效果及解凍后HP復(fù)蘇率最高的為腦心浸液加甘油制成的冷凍保存液，保存溫度為-70℃。而其它保存方法，如凍干保存法和布氏肉湯保存法，前者HP菌體復(fù)蘇率極低，后者隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株數(shù)量不斷減少。

1.2 培養(yǎng)基類(lèi)型

當(dāng)由人體胃組織樣本獲得的HP復(fù)蘇后，可以通過(guò)多種方式進(jìn)行體外繁殖培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)基包括：布氏瓊脂、哥倫比亞瓊脂、腦心浸液瓊脂和胰蛋白酶大豆瓊脂。在前述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加羊或馬血清（5%～10%）[2]。血制品也可以用高脂牛血清蛋白（AlbuMAX II）等代替[4]。另外，胰蛋白酶大豆瓊脂可以不添加血清，作為HP的無(wú)血清培養(yǎng)基。需要說(shuō)明的是，上述培養(yǎng)基中無(wú)論是加入血清還是全血，最終的培養(yǎng)結(jié)果并沒(méi)有明顯的差別，之所以建議加入血清，是因?yàn)榧尤肴呐囵B(yǎng)基，其顏色會(huì)越來(lái)越深，從而影響觀(guān)察菌株生長(zhǎng)情況。

1.3 培養(yǎng)條件

HP體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境非常重要。首先，HP的生長(zhǎng)需要充分的二氧化碳（5%～10%）[5-6]。原因是多方面的，如丙酮酸通過(guò)二氧化碳固定作用產(chǎn)生的產(chǎn)物可能為碳同化提供了途徑[7]。同時(shí)，HP產(chǎn)生的碳酸酐酶具有催化CO2與HCO3-相互轉(zhuǎn)化的作用。因此CO2可能在酸堿平衡調(diào)節(jié)中起作用[8]。其次，HP是一種對(duì)氧氣非常敏感的微需氧微生物，因此，當(dāng)對(duì)病理組織樣本來(lái)源的HP進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，微需氧環(huán)境尤為重要。從實(shí)驗(yàn)室獲取的HP在從微需氧（＜5%）到充分有氧（21%）[5]，環(huán)境中均可以順利生長(zhǎng)。另有報(bào)道稱(chēng)HP的幾個(gè)特性，如溶血素形成、甲硝唑耐藥、鐵氧還蛋白氧化還原酶（ferredoxin reductase，F(xiàn)DXR）活性以及降低上皮細(xì)胞可塑性等，可能也取決于培養(yǎng)HP所采用的是微需氧或是足量氧環(huán)境。所以，關(guān)于HP體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境原則是：低氧、高CO2。有學(xué)者在培養(yǎng)過(guò)程中采用氣體條件為 85%N2、10%CO2、5%O2時(shí)菌體生長(zhǎng)良好[9]。這一氣體比例也在后續(xù)的大量培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中被采用，均取得了不錯(cuò)的培養(yǎng)效果，因此，可將該氣體比例作為HP體外培養(yǎng)的最適氣體環(huán)境。

培養(yǎng)液的pH值也是影響培養(yǎng)效果的一個(gè)重要因素。在上世紀(jì)末，曾有學(xué)者認(rèn)為HP生長(zhǎng)的最適pH為4～10[10]，該pH范圍過(guò)大，而且經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)證實(shí)該觀(guān)點(diǎn)不可靠。后來(lái)，曾浩等學(xué)者經(jīng)過(guò)多pH梯度的HP培養(yǎng)研究確定最適pH為7.5[11]。這一觀(guān)點(diǎn)也得到了后續(xù)眾多學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果的證實(shí)。

HP培養(yǎng)的濕度要求越高越好，培養(yǎng)環(huán)境的濕度至少應(yīng)當(dāng)在90%以上。而關(guān)于HP的最適溫度，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)培養(yǎng)溫度控制在（37±3）℃時(shí)，HP均生長(zhǎng)良好。但多數(shù)學(xué)者在進(jìn)行HP體外培養(yǎng)時(shí)，選擇了37℃，結(jié)果菌體也生長(zhǎng)良好，因此，本文中HP最適生長(zhǎng)溫度取為37℃。

綜上所述，HP體外培養(yǎng)的最優(yōu)方案總結(jié)如下：首先選擇前述任一種培養(yǎng)基，加熱溶解，在溫度降至40℃～50℃時(shí)加入胎牛或羊血清（亦可用脂牛血清蛋白代替）（5%～10%）。再加入配制好的1%的抗生素混合液（萬(wàn)古霉素6mg/L、兩性霉素2mg/L及TMP 5mg/L）。調(diào)節(jié)pH為7.5，培養(yǎng)基凝固后，將活檢組織經(jīng)非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到的HP菌液接種，置入含充足CO2的微需氧環(huán)境（5%O2、10%CO2、85%N2或其他不影響菌體生長(zhǎng)的氣體）培養(yǎng)罐或其它密閉裝置中，在溫度37℃，濕度90%～100%條件下培養(yǎng)72小時(shí)左右，即可出現(xiàn)HP菌落，取少量菌落行革蘭染色或尿素酶實(shí)驗(yàn)鑒定是否培養(yǎng)成功。另有研究指出，如需要進(jìn)行菌體的集中培養(yǎng)，運(yùn)輸條件為低于24℃，且在24小時(shí)內(nèi)完成[12]。

2 液體培養(yǎng)基

2.1 培養(yǎng)基類(lèi)型

當(dāng)需要進(jìn)行HP的體外大量繁殖培養(yǎng)時(shí)，最常用的液體培養(yǎng)物是含胎牛血清（5%～10%）的布氏肉湯培養(yǎng)基。而胎牛血清可由環(huán)糊精、活性炭或者淀粉代替[13]。動(dòng)物血清提升HP增長(zhǎng)率可能與紅細(xì)胞有關(guān)系，但環(huán)糊精、活性炭或者淀粉提高HP生長(zhǎng)率的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，可能的原因是血清中含有相關(guān)的生長(zhǎng)刺激因子，而環(huán)糊精、活性炭及淀粉可以吸附菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的脂肪酸或其它有毒代謝物[14-15]。目前，用含有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐對(duì)HP進(jìn)行大規(guī)模體外培養(yǎng)已經(jīng)取得了成功。

2.2 培養(yǎng)條件

在一些實(shí)驗(yàn)中，用組成成分單一或成分明確的培養(yǎng)基取得的培養(yǎng)效果比前面提到的組成復(fù)雜而具體成分不明的培養(yǎng)基更好，而成分明確的培養(yǎng)基含有：多種鹽分、嘌呤、維生素、氨基酸等。成分明確的培養(yǎng)基中可以添加牛血清蛋白或環(huán)糊精與膽固醇的混合物以加強(qiáng)菌體繁殖效果。使用成分明確的培養(yǎng)基幫助人們對(duì)HP培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件、生理學(xué)特性和代謝特點(diǎn)有了更深的了解，同時(shí)也促進(jìn)了菌體胞外蛋白表達(dá)譜的研究[16-17]。

幾乎所有的HP菌株生長(zhǎng)均需要精氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸和纈氨酸，這與人類(lèi)所需的基本氨基酸類(lèi)似，不同菌株對(duì)丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、脯氨酸和異亮氨酸的需求也有所不同，菌株生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分還包括：丙酮酸鹽、維生素B1和次黃嘌呤。HP對(duì)氨基酸需求的不同與HP菌體對(duì)應(yīng)的生物合成基因的缺失有關(guān)[18]。

同時(shí)，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行HP培養(yǎng)時(shí)，通氣裝置需要嚴(yán)格消毒，防止污染，同時(shí)有學(xué)者研究證實(shí)向培養(yǎng)罐中加入前文所述的混合抗生素也是必須的[19]。

總體而言，HP的體外培養(yǎng)技術(shù)目前已經(jīng)基本成熟，現(xiàn)有的培養(yǎng)方式基本可以滿(mǎn)足日常的科研工作及生產(chǎn)需要，但是，關(guān)于HP的體外培養(yǎng)，仍然有問(wèn)題需要進(jìn)一步得到解決。

3 目前存在的問(wèn)題

HP在體外的生長(zhǎng)與在體內(nèi)的生存環(huán)境生長(zhǎng)之間有差別。HP在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)所必須的細(xì)菌蛋白，在體外培養(yǎng)時(shí)卻并非必不可少，如尿素酶（一種含鎳金屬酶），它對(duì)HP在胃內(nèi)的生長(zhǎng)是必須的[18，20]，但體外培養(yǎng)時(shí)，它并非必需物質(zhì)。鎳元素對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)的HP是必須的，但體外培養(yǎng)時(shí)它也并非必需。體外培養(yǎng)時(shí)，HP可以利用游離的鐵元素，但在體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)，HP只能利用血紅素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及乳鐵蛋白作為鐵元素的來(lái)源。這說(shuō)明，HP菌體在機(jī)體內(nèi)、外生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求、營(yíng)養(yǎng)獲取方式和代謝特點(diǎn)可能不同，即是HP在機(jī)體內(nèi)、外的生物特性或理化性質(zhì)可能發(fā)生了改變，這就有可能使得我們的研究從一開(kāi)始就出現(xiàn)偏差，最終的結(jié)果自然也不一定可靠。因此，要更好地認(rèn)識(shí)和研究HP應(yīng)該滿(mǎn)足的最佳條件是：體外培養(yǎng)獲得的HP與體內(nèi)定植的HP菌體的生物學(xué)特性非常相似甚至是完全一樣。這對(duì)HP的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件又將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

那么為了使體外培養(yǎng)獲得的HP在生物特性、理化性質(zhì)等方面更加接近于機(jī)體內(nèi)部的HP，甚至是完全與之相同，截至目前，廣大學(xué)者已經(jīng)利用不同的動(dòng)物模型進(jìn)行HP體外培養(yǎng)，涉及到的動(dòng)物包括貓、狗、獼猴、大鼠和小鼠等。經(jīng)過(guò)大量模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：由于動(dòng)物模型內(nèi)常駐菌群與人體相差較大，不能很好的模擬人類(lèi)自然病變，同時(shí)，不同物種對(duì)HP反應(yīng)差異較大，因此無(wú)法建立典型的病理及免疫反應(yīng)模型[21-22]。除此之外，我們可以設(shè)想是否可以將離體的器官（如胃），制作為一個(gè)擬態(tài)系統(tǒng)，使之內(nèi)部生長(zhǎng)條件與實(shí)際機(jī)體內(nèi)胃的環(huán)境及其相似，以這一擬態(tài)系統(tǒng)作為HP體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行HP的培養(yǎng)，使獲得的HP菌株無(wú)論是在生物學(xué)特性上（包括粘附致病能力，產(chǎn)生并釋放毒素和相關(guān)致病蛋白的能力等），還是在理化性質(zhì)上都與人體內(nèi)部的HP基本一致甚至相同，截止目前，筆者尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)這方面的報(bào)道，但目前已經(jīng)有學(xué)者將離體的老鼠胃作為模型，進(jìn)行HP致癌機(jī)制的研究并取得了不錯(cuò)的效果[23]，相信未來(lái)這方面的技術(shù)難題終會(huì)被人們攻克。

目前，HP體外培養(yǎng)的條件已經(jīng)成熟并在日常臨床級(jí)科研工作中廣泛應(yīng)用，HP的培養(yǎng)已不再像以前一樣困難重重，但是，關(guān)于HP培養(yǎng)仍然存在一些問(wèn)題，比如體外培養(yǎng)得到的HP菌株與機(jī)體內(nèi)部菌株的代謝特點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)需求、營(yíng)養(yǎng)獲取方式仍有一定差別，這也需要我們研究出更先進(jìn)的培養(yǎng)方式，使獲得的菌株在生化特點(diǎn)、生物學(xué)特性等方面更加接近于人體內(nèi)部菌株，更好的為相關(guān)科學(xué)研究服務(wù)。

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