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        99mTc標記磁性納米Fe3O4顆粒雙模態(tài)探針的制備及其成像實驗研究

        2018-05-11 06:19:50
        中國醫(yī)藥科學 2018年8期

        杜 鵬 劉 紅 姚 琦 馬 倩 習 玉 峰

        湖北大學中藥生物技術省重點實驗室,湖北武漢 430062

        磁性聚合物微粒是采用一定的合成方法,將具有磁性的物質和高分子聚合物反應而制成的一種新型聚合物材料。可以獲得具有長血液循環(huán)時間的磁性氧化鐵納米顆粒,也可以通過與特定的配體或受體的偶聯(lián)結合,從而獲得功能更為復雜的磁性氧化鐵納米顆粒MRI分子影像探針[1,15]。Fe3O4納米顆粒以其超順磁特性在磁共振成像(MRI)中表現(xiàn)出獨特的造影劑功能,并具有良好的生物安全性和表面可修飾性等諸多優(yōu)點,因此磁性納米顆粒在生物醫(yī)學上展現(xiàn)出巨大的應用價值[2]。造影劑可以增強信號對比度和提高軟組織圖像的分辨率,用于惡性腫瘤的早期診斷及鑒別。在影像醫(yī)學研究中Fe3O4納米顆粒已成為最受青睞的MRI造影劑[3]。

        本實驗室已經合成與表征了具有一定超順磁性,粒徑分布均勻的Fe3O4納米微粒,本文中主要選用此顆粒為核心,在其表面偶聯(lián)上99mTc(锝)和RGD小肽,制備SPECT/MRI雙模態(tài)探針。主要考察該雙模態(tài)探針應用于裸鼠模型的SPECT/MRI成像,研究其在體內體外的靶向行為。

        1 實驗部分

        1.1 實驗材料

        二亞乙基三胺五乙酸二酐(DTPA二酐),Tween-20分析純,透析袋(mw,8000~ 14000),均由國藥集團化學試劑有限公司;羧基聚乙二醇(mw,2000)(HOOC-PEG-COOH)、氨基聚乙二醇(mw,2000)(HOOC-PEG-NH2)、DMSO 和 RGD小肽(C(RGDyK))均由炎怡生物技術公司提供;超凈臺、CO2培養(yǎng)箱,Therome公司;正置熒光顯微鏡DM2500,Leica(德國)公司;3T Trio 磁共振成像儀系統(tǒng),西門子(德國)公司;SPECT/CT,Bioscan(美國)公司;烘箱LC-213,上海愛斯佩克環(huán)境設備有限公司;電子天平PB602-N,METELER TOLEDO公司;超聲波清洗器USC-202,上海波龍電子設備公司;高速離心機Microfuge 16,BECKMAN COULTER公司;動態(tài)光散射(DLS)儀、粒度分析儀Nano-ZS,Malvern公司;γ放射免疫計數(shù)器GC-1200,中佳光電公司;超濾管HyClone(美國)公司;Milli-Q 純水系統(tǒng)制備溶液配置用水。人肺癌H1299細胞株、裸鼠BALB/C-nu購自上海斯萊克動物實驗有限公司。

        1.2 SPECT/MRI雙模態(tài)靶向探針的制備

        1.2.1 Fe3O4@PEG-DTPA-RGD的制備及DLS測量顆粒的水力學尺寸 (1)配制15mL混合液(HOOC-PEG-NH21mL,HOOC-PEG-COOH 1mL,F(xiàn)e3O4透析液2mL(本實驗室準備),PBS 11mL),超聲1小時。(2)將15mL混合液置于分子量30K的超濾管中,5000rpm,10min,上層約有5mL殘留,加 PBS 5mL,5000rpm,10min,重復 2次,以除去游離PEG。(3)將殘留液轉移至分子量3K的超濾管中,6000rpm,15min,約 2mL 殘留,靜置后有沉淀,上清呈深棕色。(4)以DMSO為溶劑,配制DTPA二酐-DMSO溶液,濃度為1mg/mL。(5)取DTPA二酐-DMSO溶液100μL,加到(3)中殘留液中,振蕩 1min,5000rpm,15min,約 200μL殘 留,加 PBS 3mL,5000rpm,10min,重復 2次,以除去 DMSO 及游離DTPA,約1mL殘留。(6)取8mLPBS與10mL離心管中,加入2μL Tween-20。(7)稱取20mg NHS、20mg EDC,分別置于2個EP管中,在兩管中各加入400μL(6)中溶液,混勻。(8)從(7)兩管中各取出200μL溶液,加入以新EP管中,再加入 (5)中殘留液(Fe3O4@PEG-DTPA)50μL。(9)渦旋10s,將EP管固定在垂直混合儀上,室溫反應15min。(10)將50μg RGD小肽投入(9)溶液中。(11)在37℃中振蕩3小時,反應完成后,封口在4℃保存。

        1.2.2 99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD (1)稱取 10mg SnCl2,溶于 10mL 10mM 的 HCl溶液,混勻。配制0.25 mM的乙酸銨溶液。(2)取40μL Fe3O4@PEG-DTPA-RGD溶 液,40μL的 0.25 mM乙酸銨溶液,20μL PBS 溶液,10μL Na99 mTcO4溶液,混勻。反應一小時,每20min渦旋1min,使其充分反應。(3)反應結束后,用薄層色譜法(TLC)檢測探針的放化純度。取1mm×10mm層析紙條,在一端1cm處用鉛筆畫一虛線,在虛線中點3μL樣品,將有虛線一端浸入丙酮中,待丙酮跑到層析條4/5處,取出層析條。將其剪為4段,用表面沾污儀分別檢測者4段的核素活度。見圖1。

        圖1 Fe3O4@PEG-DTPA-RGD的制備原理

        1.2.3 用動態(tài)光散射(DLS)儀測量顆粒的水力學尺寸 制備的探針溶液,用PBS(pH=7.4)和超純水稀釋到適量的濃度,分別在在不同的時間點(0h、2h、6h、8h、24h)測量顆粒的水化直徑。見圖 2。

        圖2 Fe3O4@PEG-DTPA分別在水中和在PBS中不同時間點的水合直徑

        1.3 探針的細胞靶向性分析

        采用Fe3O4@PEG-RGD探針和Fe3O4@PEG與H1299細胞共培養(yǎng),時間梯度為1h、2h和3h,探針濃度定為2mM;分為三組:靶向組,加入2mM靶向探針Fe3O4@PEG-RGD共培養(yǎng);對照組,加入2mM的非靶向探針Fe3O4@PEG共培養(yǎng);競爭組中,加入濃度為1.5×10-3mg/mL的多肽,加入2mM靶向探針Fe3O4@PEG-RGD的共培養(yǎng)。

        將18mm×18mm的蓋玻片在75%中浸泡5s,在火焰上烘干蓋玻片,放入六孔板中(一孔一片)。將生長狀態(tài)良好的H1299細胞取400μL,滴于蓋玻片上,待細胞貼壁后,吸出培養(yǎng)基,加入含指定濃度探針的培養(yǎng)基,培養(yǎng)至指定時間,吸出培養(yǎng)基,用PBS清洗三次,進行普魯士藍染色。具體操作如下:細胞普魯士藍染色:利用三價鐵與亞鐵氰化鉀在酸性條件下反應,能夠生成普魯士藍,來定性分析細胞對納米鐵粒子的吞噬情況。將細胞鋪板,并照上面過程共培養(yǎng)并處理后,采用4%的多聚甲醛固定10min,吸出固定液后風干15min,再用 PBS 浸泡5min。加入 10%的 Prussian blue (K4Fe(CN)63H2O)浸 泡 5min,再 用 Prussian blue (K4Fe(CN)63H2O)和20% HCl (1:1)混合液浸泡45min,用水浸泡5min。用核固紅染 15min。然后依次用75%,95%,100%乙醇(2次)梯度脫水并風干,用二甲苯浸泡玻片,并最終用中性樹脂封片。待晾干后置于顯微鏡下(LEICA DM2500)觀察拍片[4]。

        1.4 探針的SPECT/MRI成像實驗[5-6]

        在15只BALB/C-nu裸鼠右上肢腋下皮下接種人H1299細胞株,細胞液用量200μL,約含腫瘤細胞3×107個。接種后約2周,腫瘤直徑長至約1.0cm時用于實驗。

        (1)SPECT/CT成像:取5只已建立腫瘤模型的BALB/C-nu裸鼠,分為三組:靶向組、競爭組和對照組。尾靜脈注射探針,靶向組每只注射900uci99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針(200μL);競爭組每只提前15min注射100mg RGD,然后每只注射900uci99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針(200μL);對照組每只注射900uci99mTc標記Fe3O4@PEG探針(200μL),探針注射后分1h、3h成像。

        NanoSPECT/CT每只小鼠在進行SPECT顯像之前首先進行CT掃描,CT掃描參數(shù)選取256×512的幀分辨率、45 kVp的球管電壓和0.15 mA電流以及500 ms/幀的曝光時間,小鼠全身掃描時間約為7分鐘,在采集圖像的同時通過Nucline 1.02軟件(匈牙利Mediso公司)進行實時圖像3D重建。CT掃描結束后,進行同機SPECT掃描,SPECT掃描選用4個高分辨9孔板配合錐形準直器同時實現(xiàn)圖像的高分辨及高靈敏度,能峰選擇140KeV,窗寬10%,掃描參數(shù)選擇1 mm/pixel的分辨率及 256 × 256的矩陣排列以及24個投影和60s/投影的掃描時間,小鼠全身掃描約需33分鐘,掃描完成后,圖像通過InVivoScope 1.44軟件(美國Bioscan公司)進行3D-OSEM重建,重建算法選擇4個子集及6次迭代計算,重建分辨率為0.4 mm/pixel。見圖4。(2)MRI成像:取9只已建立腫瘤模型的BALB/C-nu裸鼠,分為三組:靶向組、競爭組和對照組。尾靜脈注射探針,靶向組每只注射200μL99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針(含鐵0.5mg);競爭組每只提前15min注射100mg RGD,然后每只注射200μL 99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針(含鐵0.5mg);對照組每只注射200μL Fe3O4@PEG探針(含鐵 0.5mg)。

        探針注射后3h ,上機檢測前,每只裸鼠注射150μL麻醉劑(8%水合氯醛:氯胺酮=2:13,v/v)。分別采用T1加權和T2加權序列成像,參數(shù)如下:T1加權自旋回波序列:TR=500ms,TE=10ms,F(xiàn)OV=75×100mm2,data matrix=192×256,slice thickness=2mm,掃描4次;T2加權自旋回波序列:TR=1500ms,TE=83ms,F(xiàn)OV=75×100mm2,data matrix=192×256,slice thickness=2mm,掃描 4次。

        1.5 裸鼠體內核素濃度測定及腫瘤組織中探針的分布

        SPECT/CT成像結束后,將5只裸鼠斷頸處死,取下全身各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉)和腫瘤,γ放射免疫計數(shù)器測量上述器官中殘余的核素濃度,除以成像實驗前注射的總的核素濃度,再除以該器官的質量,即可得到ID/g%。

        MRI成像結束后,將9只裸鼠斷頸處死,取下腫瘤組織,放于-80℃保存。

        2 結果與討論

        2.1 Fe3O4@PEG-DTPA顆粒分別在水中和在PBS中不同時間點的水合直徑

        由圖2可知,F(xiàn)e3O4@PEG-DTPA在水中和PBS中的DLS圖譜峰型較單一,特別是在PBS中,各峰的重合度較好。Fe3O4@PEG-DTPA在PBS中的水合粒徑為120nm,F(xiàn)e3O4@PEG在PBS中的水合粒徑為100nm,二者相差20nm,說明DTPA成功與Fe3O4@PEG偶聯(lián)。分散系數(shù)在0.3左右,說明Fe3O4@PEG-DTPA在兩種溶劑中的單分散穩(wěn)定性較好。

        表1 99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針在裸鼠各主要器官的殘余核素活度

        2.2 探針的細胞靶向性分析結果

        放化純度的測定顯示99mTc的標記率在90%左右,說明標記良好。

        H1299細胞對靶向探針的吞噬量要高于非靶向探針的吞噬量。游離多肽RGD的加入能夠一定程度上抑制細胞對靶向探針的吞噬。對照組b、e和h顯示,細胞對非靶向探針的吞噬量隨時間增加。

        游離多肽RGD的加入能與靶向探針競爭細胞表面的受體,抑制細胞對靶向探針的吞噬,在與游離多肽RGD共培養(yǎng)1小時,2小時與3小時后細胞對探針的吞噬從競爭組f、i來看沒有明顯差異。說明在短期內游離多肽RGD對靶向探針的抑制作用明顯。

        圖3 H1299細胞與99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針在不同時間共培養(yǎng)下普魯士藍染色結果

        2.3 SPECT/CT成像結果及分析

        在注射探針1小時后,靶向組(圖4a)可看出腫瘤部位。競爭組(圖4d)中能看出腫瘤部位,該腫瘤中心已經壞死,而且探針主要分布在腫瘤的表面。在注射探針三小時后,靶向組(圖4c)的腫瘤部位在圖中沒有顯示。而在競爭組(圖3d)中腫瘤的中心部位有少量探針,說明隨著時間的增加,探針隨著體內代謝而排出體外。

        由表1可以看到99mTc標記Fe3O4@PEGDTPA-RGD探針在肝、腎、肺部積蓄較多。說明當探針注射到體內后,被肝臟吞噬較多。

        圖4 99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPARGD探針在裸鼠SPECT/CT成像圖

        2.4 MRI成像結果及分析

        圖5顯示出,靶向組、競爭組和對照組之間的成像有差異,尤其是在T2加權成像中,在靶向組f圖中出現(xiàn)的黑色區(qū)域是三組中最廣的,競爭組g圖其次,對照組h最少。說明99mTc標記Fe3O4@PEGDTPA-RGD探針能在腫瘤部位富集,提高了信號強度,有一定的靶向性。比較靶向組與Pre-injection的圖片,b圖中的腫瘤部位比a圖中的腫瘤部位亮度要高;f圖中的腫瘤部位比e圖中的腫瘤部位的邊緣部位要暗。在f、g和h圖中,腫瘤部位出現(xiàn)不同程度的暗區(qū),說明該探針具有較好的T2成像效果。在b圖和d圖中腫瘤的邊緣部位的亮度有稍有加強,T1成像效果也很明顯,99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針具有T1造影潛能。

        圖5 99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPARGD探針在裸鼠MRI成像圖

        3 討論

        制備的99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD雙模態(tài)探針,通過修飾納米顆粒,在表面偶聯(lián)上共聚物等高分子材料與現(xiàn)有的小分子造影劑相比,其有著更高的體內安全性和檢測靈敏度,已成為構建新型MRI造影劑的首選材料[7]。

        多肽RGD能夠與細胞表面的αvβ3受體特異性結合,并通過整合素-親和素強相互作用被細胞吞噬。游離多肽RGD的加入能夠一定程度上抑制細胞對靶向探針的吞噬[8],這種競爭作用在短時間內作用明顯,在較長時間內的競爭作用還需驗證。

        在體內腫瘤成像實驗中,探針的靶點主要是新生血管內皮細胞。新生血管內皮細胞表面表達αvβ3受體,在SPECT/CT成像以及MRI成像中,腫瘤邊緣的信號強于腫瘤的中心區(qū)域,說明新生血管在腫瘤內部分布不均勻,邊緣新生血管豐富而內部缺血,細胞大量壞死[9-10]。ID/g%的分布實驗同樣也證明了靶向探針具有良好的靶向性,能在腫瘤部位富集。

        在MRI成像中,縱向弛豫時間T1、橫向弛豫時間T2是基本物理量,能定量反映組織弛豫特性。在主磁場固定的情況下,組織的弛豫特性基本穩(wěn)定。通過測量腫瘤組織弛豫時間可以定量的評價腫瘤組織特性,有助于腫瘤的診斷以及評估患者的療效和預后[11]。磁共振造影劑在靶組織內大量聚集,提高水中質子的弛豫速率,從而增強正常與病變組織之間的磁共振信號對比度,提高成像分辨率,可分為T1造影劑和T2造影劑[12]。T1造影劑可以提供亮信號,超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIOs)是經典的T2造影劑,它的最大的缺點在于其固有的陰性造影效果和磁敏感偽影,T1-T2雙模成像策略在這一需求下應運而生,力求提供互補的成像信息以提高診斷的精確性。磁性納米顆粒不僅具有優(yōu)良的磁學性質,也具有良好的的生物安全性和表面可修飾性,因此基于磁性納米顆粒的雙模造影劑已成研究熱點[13-14]。

        本實驗三個組在注射探針后T2加權成像中,腫瘤邊緣部位均出現(xiàn)不同程度的暗斑,說明探針能作為T2造影劑。在T1加權成像中,腫瘤的邊緣部位比在探針注射前亮度有所提升。因此,制備的99mTc標記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD雙模態(tài)探針既具備T2造影能力,又具有T1造影潛能。同時,其新穎的結構為雙模造影劑的設計提供了新思路。

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