薛曉帆， 齊 丹， 李新輝， 劉 冉， 張海東， 曲愛娟， 周立春

腦卒中作為死亡率及致殘率最高的疾病嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量[1，2]，動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)，尤其是頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是引發(fā)缺血性腦卒中發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，CAS造成的缺血性腦卒中占全部腦卒中的19%～35%[3]。隨著CAS的進(jìn)展，不穩(wěn)定斑塊的破裂形成血栓，栓塞脫落后引發(fā)腦卒中是缺血性腦卒中的重要發(fā)病機制，“氧化應(yīng)激學(xué)說”作為AS斑塊穩(wěn)定性下降的可能發(fā)病機制之一被人們廣泛關(guān)注，但具體信號通路及分子機制目前仍不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3(silent mating type information regulation2 homolog-3,SIRT3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide,NAD)的Ⅲ類去乙?；竅4]。SIRT3主要位于線粒體，廣泛分布于腎臟、腦、心臟及肝臟等富含線粒體的組織器官中，可對組蛋白和非組蛋白去乙?；谡{(diào)控細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壽命方面起著重要的作用[5，6]。SIRT3通過去乙?；嚓P(guān)蛋白調(diào)節(jié)生物活性，在抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等多種心血管疾病中，都起到了保護(hù)性作用，但在粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)及與之相關(guān)臨床意義之間的研究甚少[7,8]。因此，了解SIRT3在AS斑塊形成及穩(wěn)定性中的作用，及可能調(diào)控的信號通路具有學(xué)術(shù)價值，對早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)從而減少缺血性心腦血管疾病的發(fā)生，有著至關(guān)重要的意義。本文采用免疫組化、免疫印跡法及免疫熒光共定位法檢測6例人頸動脈組織中SIRT3的表達(dá)情況，并探討其與AS斑塊形成及發(fā)展之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2017年4月～2017年9月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院尸檢中心行尸體解剖檢查且個人資料完整的6例患者，其中男5例，女1例，年齡分布39～85歲，取其雙側(cè)完整頸動脈(頸總動脈+頸動脈竇部+頸內(nèi)動脈+頸外動脈)長度約8～10 cm，所取左側(cè)完整組織分段進(jìn)行石蠟切片完成H&E染色、Masson’s trichrome染色，冰凍切片完成油紅O染色、免疫組化染色及免疫熒光共定位染色；所取右側(cè)組織放入液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存用于免疫印跡法檢測SIRT3表達(dá)含量。所取標(biāo)本及相關(guān)流程已得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 H&E染色、Masson’s trichrome染色及油紅O染色 所取6例左側(cè)頸動脈組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，一部分常規(guī)石蠟包埋，制作頸動脈石蠟切片(4 μm)10張，常規(guī)蘇木精-伊紅染色(H&E染色)，中性樹膠封片2張；另一部分用于冰凍切片(7 μm)，Masson’s trichrome染色:(1)冰凍切片復(fù)溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內(nèi)10%重絡(luò)酸鉀+10%三氯乙酸染色40 min后蒸餾水洗2～3遍;(4)用0.09 g麗春紅+0.01 g酸品紅+100 μl冰醋酸+9.9 ml蒸餾水配制的紅色染料染色5 min;(5)1%磷鉬酸浸泡5 min后，1%冰醋酸沖洗1～2遍，鏡下觀察上色情況;(6)用0.24 g苯胺藍(lán)+200 μl冰醋酸+9.8 ml蒸餾水配制的藍(lán)色染料染色30～40 s，后用1%磷鉬酸及1%冰醋酸各沖洗一遍，鏡下觀察上色情況;(7)無水乙醇中浸泡5 s后中性樹膠封片保存,染色2張，油紅O染色:(1)冰凍切片復(fù)溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)60%異丙醇滴染同步化10 min;(4)甩掉并擦干凈異丙醇溶液，以0.25油紅粉末+50 ml異丙醇配制的0.5%油紅染料用蒸餾水稀釋成濃度為60%的油紅染料染色30 min;(5)異丙醇沖洗后用蒸餾水洗3遍，鏡下觀察染色情況;(6)甘油明膠封片,2張，鏡下觀察6例人頸部血管組織病理學(xué)特點，按照動脈粥樣硬化斑塊病理學(xué)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[9](Ⅰ期脂紋脂斑期;Ⅱ期纖維斑塊期;Ⅲ期粥樣斑塊期;Ⅳ期復(fù)合病變期)。

1.3 免疫組化 采用免疫組化Max Vision二步法:第1天：(1)冰凍切片復(fù)溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內(nèi)以內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織20 min后蒸餾水洗3遍;(4)羊血清封閉非特異性抗原濕盒內(nèi)30 min;(5)甩掉浮液后加入以1∶100配制SIRT3抗體(兔多克隆Anti-SIRT3抗體-C-terminal，abcam公司，貨號ab137689)4 ℃冰箱過夜12 h。第2天：(1)室溫復(fù)溫30 min，蒸餾水洗3遍;(2)山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(CST公司，貨號7074)室溫孵育30 min后蒸餾水洗3遍;(3)配制DAB顯色劑(上海基因科技有限公司，貨號GK600505/50次，GK600510/100次，GK600511/1000次)染色7～10 s，鏡下觀察組織顯淡黃色后置于蒸餾水中浸泡;(4)蘇木素染色10～15 s;(5)鹽酸分化液洗片2～3 s;(6)流水沖洗反藍(lán)5 min;(7)鏡下觀察染色情況后走免疫組化下行通路，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，已證實的SIRT3染色陽性的切片作為陽性對照組，同時選取正常血管組織作為正常對照組。SIRT3染色陽性表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)，呈清晰棕黃色顆粒。每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)以顯色細(xì)胞數(shù)面積占斑塊總面積的比值進(jìn)行評估。

1.4 免疫熒光共定位 免疫熒光共定位染色法:第1天：(1)冰凍切片復(fù)溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內(nèi)以內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織20 min后蒸餾水洗3遍;(4)羊血清封閉非特異性抗原濕盒內(nèi)30 min;(5)分別以小鼠單克隆CD31(PharMingen公司，貨號553300)、α-SMA(abcam公司，貨號ab7817)及MAC-2(SantaCruz公司，貨號sc-32790)3種抗體標(biāo)記組織中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，分別加入SIRT3抗體及PBS，以1∶1∶100分別配制3種一抗混合液，滴染各組片子4 ℃冰箱過夜12 h；第2天：(1)室溫復(fù)溫30 min，蒸餾水洗3遍;(2)以1∶1∶100比例配制山羊抗小鼠IgG/TRITC(中杉金橋公司，貨號ZF-0313)紅光二抗及山羊抗小鼠IgG/FITC(中杉金橋公司，貨號ZF-0312)綠光二抗混合液，加至片子后濕盒保存1 h后蒸餾水洗5遍;(3)DAPI封片，4 ℃保存;(4)熒光顯微鏡暗室拍照。觀察各類細(xì)胞內(nèi)SIRT3染色差異，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，Ⅰ期及Ⅳ期人頸動脈粥樣硬化斑塊組織染色陽性的切片作為陽性對照組，同時選取正常血管組織作為正常對照組。

1.5 免疫印跡法 Western blot檢測，取保存于-80 ℃冰箱的組織樣本：(1)用高效RIPA裂解液(Solarbio公司，貨號R0010)提取總蛋白;(2)采用BCA法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液;(3)100攝氏度煮沸5～10 min變性;(4)12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔上樣總蛋白約30 μg左右，后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;(5)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;(6)TBST洗膜后加入SIRT3及β-ACTIN抗體，用5%BSA稀釋，稀釋比例均為1∶1000，4攝氏度搖床過夜;(7)TBST洗膜后二抗室溫孵育1 h，運用ECL試劑盒發(fā)光、顯影、定影、沖洗晾干、拍照并成像分析，運用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，將SIRT3/β-ACTIN的比值作為蛋白表達(dá)的相對量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對Western blot檢測的蛋白相對表達(dá)量運用t檢驗，免疫組化測定結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H&E染色、Masson’s trichrome染色、油紅O染色進(jìn)行人頸動脈粥樣硬化斑塊組織的分期及臨床病理特征的分析結(jié)果 6例患者病理切片均按照動脈粥樣硬化病理分期分為2例正常血管，2例Ⅰ期脂紋脂斑期，2例Ⅳ期復(fù)合病變期。

2.2 免疫印跡法結(jié)果提示SIRT3在人頸動脈Ⅳ期粥樣硬化斑塊血管組織中顯著表達(dá) 目的條帶SIRT3分子量為29 kD，β-ACTIN分子量為43 kD。SIRT3在Ⅳ期斑塊組織中的蛋白表達(dá)量明顯高于Ⅰ期斑塊及正常血管組織(見圖1)。

2.3 免疫組化檢測SIRT3在人Ⅳ期頸動脈粥樣硬化斑塊中顯著表達(dá) SIRT3表達(dá)陽性在免疫組化染色中呈棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)染色。結(jié)果顯示2例正常血管組織中未見陽性細(xì)胞表達(dá)，2例I期斑塊組織中偶見陽性細(xì)胞，2例Ⅳ期斑塊組織中SIRT3陽性細(xì)胞表達(dá)率為40%(24/60)(見圖2)。

2.4 SIRT3在人Ⅳ期頸動脈粥樣硬化斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)均表達(dá) SIRT3由TRITC熒光二抗標(biāo)記為紅色，主要位于細(xì)胞質(zhì)染色。內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分別由CD31、α-SMA及MAC-2一抗標(biāo)記，由FITC熒光二抗標(biāo)記為綠色，細(xì)胞核由DAPI標(biāo)記為藍(lán)色，Merge后共定位染色為橙黃色。結(jié)果顯示2例正常血管組織中未見SIRT3表達(dá)，2例Ⅰ期斑塊組織中偶見少量SIRT3表達(dá)，2例Ⅳ期斑塊組織中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)均可見大量SIRT3表達(dá)。

圖1 正常頸動脈組織、Ⅰ期斑塊組織及Ⅳ期斑塊組織中SIRT3表達(dá)

3 討 論

動脈粥樣硬化(AS)是引發(fā)缺血性腦卒中發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體氧化應(yīng)激損傷作為斑塊穩(wěn)定性下降的可能機制被人們廣泛關(guān)注。多重危險因素(高脂血癥、高血壓、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、吸煙、肥胖等)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能失調(diào)，從而產(chǎn)生大量ROS，促進(jìn)過氧化物酶產(chǎn)生，同時激活內(nèi)皮細(xì)胞源性炎性因子如TNF-α及多種白細(xì)胞介素等表達(dá)[10，11]。ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)同時可誘導(dǎo)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的氧化修飾，形成修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)，引起平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡。細(xì)胞因子和ox-LDL能激活NF-κB信號通路，被激活的NF-κB遷移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)多種細(xì)胞間基質(zhì)表達(dá)，其中包括內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(VCAM)、金屬蛋白酶(MMPs)等，促使AS斑塊形成并降解細(xì)胞外基質(zhì)，削弱纖維帽，使斑塊穩(wěn)定性下降，引發(fā)血栓、斑塊破裂、斑塊內(nèi)出血、動脈瘤等多種繼發(fā)性改變[12,13]。如何維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定及線粒體功能，避免功能失調(diào)作為AS斑塊形成的啟動靶點成為AS斑塊研究的主要方向。

目前研究證實Sirt3能對線粒體內(nèi)多種乙?；鞍酌撘阴；黾覴OS清除酶活性和穩(wěn)定線粒體功能，抑制線粒體內(nèi)ROS的蓄積，改善可由ROS增多并激活NF-κB通路，減輕氧化應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞損傷過程[14]。Someya等研究證實[15]。線粒體內(nèi)Srit3過表達(dá)，使乙?；腎DH2脫乙?；?，提高NADPH的水平，抑制ROS的產(chǎn)出，延遲老年性聽力喪失疾病的發(fā)生。仍有研究證實S3過表達(dá)后，使超氧化物歧化酶-2(SOD-2)兩個關(guān)鍵的賴氨酸殘基去乙?；?，從而減少ROS的產(chǎn)生，阻礙Bax蛋白移位到線粒體，減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16]。Sundaresan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3對乙?；霓D(zhuǎn)錄因子Foxo3a脫乙酰基后，使其進(jìn)入細(xì)胞核，并提高依賴Foxo3a的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)及過氧化氫酶(CAT)的mRNA表達(dá)水平，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積，阻斷了ROS誘導(dǎo)激活的通路上游靶點Ras基因，并抑制下游信號通路MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本實驗結(jié)果初步證實了與正常人頸部血管組織相比，SIRT3在人CASIV期斑塊組織中是顯著表達(dá)的，這可能與AS斑塊形成及發(fā)展過程中線粒體氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。且在斑塊發(fā)展過程中，SIRT3的表達(dá)也存在差異，Ⅳ期斑塊組織中SIRT3表達(dá)量明顯高于Ⅰ期粥樣硬化組織，免疫印跡法檢測Ⅰ期斑塊未見SIRT3表達(dá)可能與表達(dá)量過少相關(guān)。且免疫熒光共定位染色結(jié)果提示SIRT3廣泛表達(dá)于Ⅳ期斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)。既往研究證實，SIRT3可以通過去乙?；€粒體相關(guān)蛋白，減輕ROS的累積，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性[18]。且一般情況下低氧可以誘導(dǎo)SIRT3表達(dá)增加，SIRT3在內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化信號通路中活性增強，起到維持內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能的作用[19]。由此推測，SIRT3可能參與了CAS斑塊形成過程，并起到了穩(wěn)定斑塊的保護(hù)性作用，但具體的信號通路及作用機制目前尚不明確，仍需進(jìn)一步大樣本重復(fù)試驗，本課題組將進(jìn)一步應(yīng)用動物及細(xì)胞實驗驗證上述結(jié)果，且確定SIRT3通過去乙?；畏N蛋白來發(fā)揮作用，來證實其在AS斑塊穩(wěn)定性中的角色。

綜上所述，SIRT3可能與AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其在Ⅳ期斑塊中的高表達(dá)可能在斑塊穩(wěn)定性中起到了一定作用，但目前研究SIRT3與AS斑塊形成及穩(wěn)定性之間的相關(guān)研究較少，如能確定SIRT3蛋白在斑塊穩(wěn)定性中的保護(hù)性機制，可能成為潛在的檢測指標(biāo)及基因治療的一個作用靶點，為缺血性心腦血管疾病的預(yù)防有著重要的臨床意義。

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圖2 正常頸動脈組織、Ⅰ期斑塊組織及Ⅳ期斑塊組織中SIRT3免疫組化染色結(jié)果