王冰倩 呂正濤

[摘要] 骨細胞的三維（3D）形態(tài)可以順應(yīng)機械應(yīng)力發(fā)生改變，同時骨細胞陷窩形態(tài)的變化也可以影響骨細胞作為骨主要機械傳感器的功能。因此揭示皮質(zhì)骨中骨細胞陷窩的3D形態(tài)特征對于在細胞水平下更好地了解其機械性質(zhì)結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。本文筆者基于實驗室的儀器（3D X射線顯微鏡，MicroXCT-200）拍攝的100幅連續(xù)圖像，提出了一種高效的使用ImageJ軟件對骨細胞陷窩的3D特征進行量化的圖像分析方法。通過對圖像序列的導入、閾值分割、降噪處理、反轉(zhuǎn)、填充以及邏輯運算等處理步驟，最終得到感興趣區(qū)域內(nèi)骨細胞陷窩的數(shù)量、表面積、體積以及其他用于描繪骨細胞3D特征的指數(shù)。

[關(guān)鍵詞] ImageJ；骨細胞陷窩；3D形態(tài)；皮質(zhì)骨

[中圖分類號] R336 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（c）-0172-06

[Abstract] The three-dimensional （3D） morphology of osteocytes is assumed to adapt to physiological mechanical loading， the variation in the morphology of osteocyte lacunae is hypothesized to influence the function of osteocytes as the master mechanosensors of bone. Thus， to reveal the 3D characterization of osteocyte lacunae in cortical bone is essential for a better understanding of its structure in relation to its inferior mechanical properties in a cellular level. In this paper， the authors used a series of 100 consecutive images from laboratory-based instrumentation （3D X-ray microscope， MicroXCT-200） and proposed a computationally efficient image analysis method to quantify the 3D characterization of osteocyte lacunae using ImageJ software. The number of osteocyte lacunae （N.Lc）， surface area of osteocyte lacunae （Lc.SA）， volume of osteocyte lacunae （Lc.V） and other parameters used to describe 3D characterization of osteocyte lacunae within the region of interest could be accomplished after a series of operations including importing the image stack， thresholding and despeckling， inverting， filling holes and logical calculation.

[Key words] ImageJ； Osteocyte lacunae； 3D morphology； Cortical bone

骨細胞陷窩（osteocyte lacunae）在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨組織中均大量存在，成年人類骨組織中估計有420億骨細胞陷窩[1]。正由于其數(shù)量龐大，輕微的數(shù)量上的變動都可能使骨組織的機械特性產(chǎn)生極大的改變[2-7]。骨細胞陷窩數(shù)量減少會導致骨組織孔隙率降低，所以當骨組織遭遇機械應(yīng)力時其吸收機械應(yīng)力的能力也會隨之下降，骨折風險隨之上升[8-12]。

由于骨細胞及其陷窩不像成骨細胞或破骨細胞那樣在骨的表面發(fā)揮生物學功能，骨細胞及陷窩是內(nèi)嵌在骨基質(zhì)當中，所以迄今為止用來直接觀測骨細胞陷窩形態(tài)的方法并不多[4，13]。而且單個骨細胞陷窩體積很小，一小塊骨組織也包含成千上萬的骨細胞陷窩，所以分析骨細胞的分布和形態(tài)不僅極其費時，更多地也是停留在二維方法，比如共聚焦顯微鏡[14]、掃描電鏡[15]、透射電鏡等[16]。CT及μCT等三維掃描技術(shù)越來越多地被應(yīng)用在骨細胞形態(tài)學研究中[17-19]，然而三維掃描之后的圖像序列通常大小超過1 GB，現(xiàn)存的用于三維重建的軟件比如Avizo、Amira等均需要購買昂貴的證書，而且對于電腦中央處理器和顯卡要求很高，這極大提高了骨組織樣本分析的難度和成本。

ImageJ是由美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）開發(fā)的一款基于Java語言平臺的免費圖像處理軟件，大量的免費插件也極大的拓寬了ImageJ的使用范圍。ImageJ在醫(yī)學影像診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，而國內(nèi)醫(yī)學數(shù)據(jù)庫現(xiàn)存文獻中有關(guān)如何開發(fā)或使用ImageJ的資料相對匱乏，尚未有文獻報道如何使用ImageJ軟件分析骨細胞陷窩形態(tài)的資料。因此本文旨在總結(jié)如何使用ImageJ對骨組織掃描的圖像序列進行三維重建并分析骨細胞陷窩形態(tài)學特征，建立一種利用ImageJ分析骨細胞陷窩三維特征的流程框架，為將來研究骨細胞形態(tài)學的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 ImageJ下載及安裝

ImageJ軟件的下載地址為：https：//imagej.nih.gov/ij/download.html，對應(yīng)不同的系統(tǒng)平臺選擇不同的ImageJ安裝包進行下載。截至2018年5月，最新的ImageJ版本為ImageJ 1.8.0版本。為了處理骨細胞陷窩特征數(shù)據(jù)還需要下載ImageJ的BoneJ插件[20]（http：//bonej.org/）。本文所使用的ImageJ軟件為基于Windows 10系統(tǒng)的1.8.0最新版本，BoneJ插件為1.4.2版本。

2 骨細胞陷窩特性的測量過程

2.1 導入圖像序列及圖像屬性設(shè)置

ImageJ軟件可以支持TIFF、PNG、BMP、DICOM、GIP、JEPG等多種圖片格式的輸入。在三維重建之前，首先需要在ImageJ導入一組圖像序列，使用File> Import> Image Sequence命令將100張連續(xù)的DICOM圖像序列導入ImageJ。本文使用的圖像序列為8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠的脛骨骨干內(nèi)側(cè)皮質(zhì)經(jīng)過MicroXCT-200掃描得到的圖像序列，掃描位置詳見圖1a。成功導入圖像序列之后，根據(jù)掃描樣本的實際大小設(shè)置ImageJ中的圖像序列參數(shù)，以便后期進行骨細胞陷窩體積大小篩選使用。使用Image> Properties命令，設(shè)置圖像序列的長度單位以及像素長度寬度等參數(shù)（圖1b），例如本文使用的圖像序列為100張連續(xù)的434.12 μm×445.61 μm大小的圖像。

2.2 閾值分割及降噪處理

閾值分割是利用灰度直方圖分析圖像序列的灰度分布，從而實現(xiàn)將圖像上的像素標記為背景或?qū)ο螅瑥亩鴮崿F(xiàn)對圖像序列的二值化。使用Image> Adjust> Threshold命令，在閾值分割時使用ImageJ自帶的“Default”算法，點擊Apply以后將骨細胞陷窩標記為白色，其余部分為黑色（圖2a）。此時圖像序列已轉(zhuǎn)化為二值化的圖像序列，但是圖像序列中可見有類似胡椒鹽形狀的背景噪聲，為了更好地呈現(xiàn)骨細胞陷窩形態(tài)并同時減少電腦的運算負擔，需要將圖像序列進行降噪處理。在ImageJ提供的多種過濾器中，可以選擇Median 3D或Mean 3D過濾器對圖像序列進行降噪處理，Median 3D相比于Mean 3D對圖像邊緣的保留效果更好，使用Process > Filters > Median 3D命令，得到降噪之后的圖像見圖2b。

2.3 反轉(zhuǎn)及填充

在閾值分割和降噪處理之后可以得到更加清晰的二值化圖像序列（圖2b），骨細胞陷窩標記為白色，骨基質(zhì)為黑色，外周背景為白色。將圖像序列反轉(zhuǎn)之后得到骨細胞陷窩為黑色，骨基質(zhì)為白色，其余背景均為黑色（圖3a）。此時打開圖2b，使用Process> Binary> Fill Holes命令，將圖2b中的骨細胞陷窩填充成黑色從而得到圖3b。此時將圖2b進行填充的目的是為了進行下一步的邏輯運算，以便得到骨細胞陷窩的圖像序列。

2.4 邏輯運算及感興趣區(qū)域的創(chuàng)建

為了得到骨細胞陷窩，筆者在這里使用ImageJ提供的“AND”邏輯運算功能。由于圖3a骨細胞陷窩為黑色，骨基質(zhì)為白色；而圖3b骨基質(zhì)及骨細胞陷窩均為黑色，所以AND運算之后僅骨細胞陷窩以及之前存留的背景噪聲會存留下來（圖4a）。ImageJ軟件提供了強大的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）的選擇功能，在此不做贅述。由于圖像序列中有一部分并非骨皮質(zhì)部分，筆者利用圓形選擇工具在圖4a的骨皮質(zhì)范圍內(nèi)選擇直徑為300.30 μm的圓形為ROI，去除圓圈以外的圖像得到圖4b。此時的圖4b所在區(qū)域詳見圖1a。

2.5 分析骨細胞陷窩特性

分析骨細胞陷窩的特性還需要ImageJ中的Particle Analyser插件。在打開圖4b之后，使用Plugins>Analyze > Particle Analyser命令進行分析，此時可以看到如圖5的設(shè)置頁面，其中包括測量選項（Measurement Options）以及圖像結(jié)果顯示選項（Graphical Results）。在測量選項中如果選擇了“Exclude on sides”選項則表示圖像序列邊緣的粒子不會被計入統(tǒng)計，為了避免破碎的骨細胞陷窩干擾最終的統(tǒng)計結(jié)果筆者在統(tǒng)計骨細胞陷窩特征時可以排除邊緣的骨細胞；其他的測量選項還包括是否測量骨細胞陷窩的表面積（Surface Area）、體積（Enclosed Volume）、Euler特征（Euler Characteristic）、慣性矩（Moments of Inertia）等信息，選擇的選項越多，電腦的運算負擔也會越重，得到結(jié)果的速度就越慢；“Min Volume”和“Max Volume”選項是Particle Analyser的重要過濾器，可以通過限制粒子的體積來過濾圖像中的背景噪聲，或者是體積過大的血管結(jié)構(gòu)等。

由于在圖1b中筆者已經(jīng)設(shè)置了圖像序列的真實大小，此時根據(jù)客觀骨細胞大小，將Min Volume設(shè)置為50 μm3而Max Volume設(shè)置為1500 μm3，可以得到體積范圍在50～1500 μm3的骨細胞陷窩[21]。體積小于50 μm3被認為是背景噪聲或偽影，而體積大于1500 μm3被認為是骨基質(zhì)中的血管或者哈佛管。在圖像結(jié)果顯示中，凡是標記了3D顯示的結(jié)果，均會在ImageJ的ImageJ D Viewer中顯示。而數(shù)字統(tǒng)計結(jié)果如圖6。常見的用于描述骨細胞陷窩大小的指標有骨細胞陷窩數(shù)量（N.Lc）、總的骨細胞陷窩體積（Lc.V，μm3）、平均骨細胞陷窩體積（=Lc.V/N.Lc，μm3）、骨細胞陷窩表面積（Lc.SA，μm2）。而描述骨細胞陷窩形狀的指標有骨細胞陷窩等徑指數(shù)（Lc.Eq=minor radius/major radius）、骨細胞陷窩延伸指數(shù)（Lc.El=1-int. radius/major radius）、骨細胞陷窩扁平指數(shù)（Lc.Fl=1-minor radius/int. radius）、骨細胞陷窩球形指數(shù)[SphR=（3.142）1/3（6Lc.V）2/3/Lc.SA]等。根據(jù)圖6得到的數(shù)據(jù)表，讀者可以利用Excel或者其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行計算。

2.6 圖像的3D呈現(xiàn)

除了得到數(shù)字運算的結(jié)果，ImageJ還具有骨細胞陷窩3D呈現(xiàn)的功能，以便更好地了解骨細胞陷窩的大小及分布情況。筆者以體積呈現(xiàn)（Volume Rendering）為例：打開圖6之后，使用Plugins>3D>Volume Viewer命令，會打開一個新的Volume Viewer 2.0操作界面，如圖7所示。圖7中央顯示的是100張連續(xù)圖像序列中，被選中的感興趣區(qū)域里，體積體積范圍在50～1500 μm3的121個骨細胞陷窩的體積呈現(xiàn)。使用鼠標可以對圖像序列的邊框進行拖動，得到更好的體積呈現(xiàn)效果。

3 小結(jié)

ImageJ是NIH開發(fā)的基于Java語言的一款公用多維圖像處理工具及分析平臺，可運行于Microsoft Windows、Mac OS、Mac OS X、Linux和Sharp Zaurus PDA等多種平臺。其開放源代碼、免費、支持多種插件應(yīng)用、兼容多格式圖像來源、處理速度快、占用內(nèi)存小、適用性強等特點，使其在影像學診斷、檢驗醫(yī)學等多個醫(yī)學領(lǐng)域研究分析中應(yīng)用廣泛，但目前尚未有文獻報道如何使用ImageJ分析皮質(zhì)骨中骨細胞陷窩的3D形態(tài)特征。

使用ImageJ軟件圖像處理分析作為一種客觀的評價手段，通過設(shè)定若干參數(shù)，能直接得到準確性高、重復性較好的數(shù)據(jù)，可幾乎不受主觀認知和經(jīng)驗等人為因素干擾。本研究使用ImageJ將野生型雄性C57BLI6小鼠脛骨經(jīng)過MicroXCT-200掃描得到的100張連續(xù)圖像序列進行閾值分割、降噪處理、反轉(zhuǎn)、孔洞填充、邏輯運算及劃定感興趣區(qū)域，逐步得到較準確的骨細胞陷窩的圖像序列。進一步使用ImageJ中Particle Analyser等插件，剔除圖像中背景噪聲、偽影等體積小于50 μm3的顆粒，以及體積大于1500 μm3的血管或者哈佛管，達到凈化目標圖像的目的。同時可計算、統(tǒng)計得到多類描述骨細胞陷窩大小的指標數(shù)值。為更好、更直接地呈現(xiàn)骨細胞陷窩的大小及分布情況，ImageJ可對骨細胞陷窩的3D形態(tài)特征進行量化和呈現(xiàn)，得到實驗者期望的呈現(xiàn)效果。

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（收稿日期：2018-05-17 本文編輯：蘇 暢）