李 雪
(1.遼寧省鞍山水文局,遼寧鞍山 114039;2.大連理工大學,遼寧大連 116024)
氨氧化微生物主要包括氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA),是氨氧化過程中起主要作用的角色,氨氧化過程是硝化反應中一個環(huán)節(jié),而硝化作用又是氮循環(huán)過程中關(guān)鍵的步驟,所以,氨氧化微生物的研究對更好地了解氮循環(huán)至關(guān)重要。硝化反應的實質(zhì)就是在微生物的作用下,將氨氮轉(zhuǎn)化為硝氮的過程。在氨氧化過程中,氨單加氧酶基因(amoA)編碼的酶起至關(guān)重要的作用[1],人們一直認為只有氨氧化細菌含有這種基因,直到海洋中分離出來了第一株泉古菌,人們才意識到了不是只有氨氧化細菌才有這種功能。逐漸的,氨氧化古菌被人們認為存在于多種生境中。多年以來,關(guān)于AOB、AOA在各種生境中的豐度得到了深入而廣泛的研究。Wang[2]等人在對水庫沉積物和鄰近土壤進行研究時發(fā)現(xiàn)AOA最高豐度依次出現(xiàn)在無植被生長的河邊土壤、水庫沉積物、種植蘆葦?shù)暮舆呁寥篮娃r(nóng)田土壤。Liu等人發(fā)現(xiàn)在三峽水庫好氧缺氧交替進行的條件下,AOA更適應生存[3]。
當前對于淡水生境例如飲用水水庫沉積物中在氮循環(huán)中起作用的微生物的研究較少,碧流河水庫是大連市重要的水源工程,由于水庫水土流失嚴重,每一年都有大量的氮、磷、鉀、農(nóng)藥等隨著泥沙流入該水庫,有潛在的可能會破壞水庫中氮循環(huán)的平衡,甚至會造成水體富營養(yǎng)化。為了掌握水庫氮循環(huán)及氮代謝情況和維持生態(tài)穩(wěn)定,本課題主要針對遼寧省大連市碧流河水庫庫區(qū)沉積物中參與氮循環(huán)的微生物AOA和AOB的豐度進行研究,探究在不同的環(huán)境條件影響下秋季平水期和春季枯水期水庫沉積物中AOA和AOB豐度的變化情況。
AOB是氨氧化過程中起關(guān)鍵作用的微生物,屬于變形菌的β和γ亞綱。AOB的存在范圍可分為淡水沉積物、污水、土壤和海洋4個生態(tài)類群。為了維持各類生態(tài)系統(tǒng)的平衡,環(huán)境因子對AOB影響已被廣泛研究。銨作為AOB的底物,與AOB的豐度有著密切的聯(lián)系,AOB的豐度與銨的濃度呈正相關(guān)[4]。AOB的豐度受pH的影響,季節(jié)的改變和降雨的多少也會改變pH和AOB的相關(guān)性。pH較低時,銨被轉(zhuǎn)化為氨,改變底物濃度,從而改變AOB的豐度[4]。溫度對AOB豐度的影響,要根據(jù)實際的情況來分析。生物酶要求合適的溫度才能發(fā)揮作用,不同物種往往有其最適生長溫度,所以溫度變化會影響AOB豐度。深度對沉積物中AOB的豐度影響顯著,可能與其不同深度溶解氧不同有關(guān),氧的可利用性對于海洋、湖泊、土壤和沉積物等各類生境中AOB豐度及其重要。微生物能分解有機物質(zhì),促進腐殖質(zhì)的形成,一般來說,水生系統(tǒng)中微生物的數(shù)量與有機質(zhì)的含量呈正相關(guān)。
AOA在土壤、淡水、沉積物等各類生態(tài)環(huán)境中被廣泛關(guān)注,并在自然界中起到了關(guān)鍵作用。近年來,微生物學一個顯著的成就就是發(fā)現(xiàn)了常溫型泉古菌中的一個功能類群—氨氧化古菌。AOA在銨濃度低時更加活躍,AOA適宜生長的溫度比較寬泛,在低溫或者非常高的溫度環(huán)境下,AOA的分布比較廣泛。在多數(shù)土壤環(huán)境中,當pH值低至3.7時,AOA比AOB更占優(yōu)勢,AOA的豐度隨著pH的升高而降低[5]。
該課題研究的沉積物樣品分別取自2014年10月秋季平水期和2015年4月春季枯水期的碧流河水庫庫區(qū),主要對碧流河水庫上游、中游和下游的10個不同地點進行取樣。
對實驗樣品主要測的指標有:溫度、氨氮、水深、硝氮、亞硝氮、pH值、有機質(zhì)。取一部分沉積物樣品,在50℃的條件下烘干后研磨,并用1 mm篩濾過。濾過的烘干土樣用飽和氯化鉀溶液處理,然后采用納氏試劑光度法和離子色譜測其氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量,采用PHS-25型酸度計測其pH值,利用重鉻酸鉀氧化法測定有機質(zhì)含量。
1)沉積物樣品的DNA提取與檢測
利用土壤微生物DNA強力提取試劑盒來提取沉積物樣品的DNA,提取的DNA濃度以及純度用微量分光光度計測定。
2)標準質(zhì)粒的培養(yǎng)與定量
首先選取含有AOB和AOA的沉積物,提取DNA,然后進行聚合酶鏈式反應、割膠回收、鏈接克隆挑菌,把挑出的菌放到培養(yǎng)基里培養(yǎng),之后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,最后用儀器超微量紫外分光光度計測定提取的質(zhì)粒的濃度和純度,標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)的計算公式如下[6]:
6.02×1023(拷貝數(shù)/mol)×濃度(g/ml)/MV(g/mol)=拷貝數(shù)/ml
其中,MV=3 000 bp×660 dalton/bp=1.98×106daltons
最后把提取的標準質(zhì)粒放到-20℃的條件下保存用于接下來的實驗。
3)AOB和AOA的amoA基因熒光定量分析實驗
用定量反應的試劑和引物[7]以及提取好的質(zhì)粒做AOB和AOA的定量實驗,定量反應均在定量分析儀上進行,熒光定量反應引物及反應條件見表1、反應組分見表2,最后對熒光定量實驗的最終數(shù)據(jù)進行準確的分析,從而得出AOB和AOA的拷貝數(shù)。
表1 實驗使用的引物和反應條件
表2 熒光定量實驗反應組分(AOA和AOB)
實驗主要利用軟件統(tǒng)計產(chǎn)品與服務解決方案(SPSS)中的皮爾森相關(guān)性統(tǒng)計學方法分析AOA和AOB豐度和沉積物理化因子之間的關(guān)系。
水庫沉積物對水庫水質(zhì)有重要影響,并且氨氧化微生物的生長和豐度有可能受到沉積物環(huán)境因素的影響,所以了解沉積物所處的環(huán)境條件有助于更好地分析沉積物中AOA和AOB的豐度受環(huán)境因子影響的變化情況。課題選取的是碧流河水庫庫區(qū)沉積物,2個時期各個采樣點的詳細資料和理化指標見圖1。
圖1 碧流河水庫庫區(qū)8個采樣點的理化性質(zhì)
實驗中各個采樣點分別來自碧流河水庫庫區(qū)上中下游不同位置。從圖1中可知沉積物中亞硝氮的含量較低,可以忽略。2個季節(jié)沉積物中的氨氮含量均為下游最多,中游次之,上游最少,硝氮的濃度都很低。同一個季節(jié),不同采樣點水深、氨氮和有機質(zhì)3個環(huán)境因子差異較大,而其他的環(huán)境因子之間的差異較??;同一個采樣點,不同季節(jié)溫度和氨氮2個環(huán)境因子差異較大,而其他的環(huán)境因子之間的差異較小。
3.2.1 沉積物的DNA提取結(jié)果與分析
各個樣品提取的DNA的濃度在13.1~28.5 ng/μl,純度較高。
3.2.2 沉積物中AOB和AOA的amoA基因定量結(jié)果分析
分別對AOA和AOB的amoA基因的質(zhì)粒進行1∶5的等梯度稀釋,用稀釋得到的5個標準點繪制標準曲線,在實驗中得到R2≥0.98的標準曲線。熒光定量標準曲線的詳細結(jié)果見表3,標準曲線準確性良好。
表3 AOA和AOB的amoA基因熒光定量實驗標準曲線結(jié)果
圖2 采樣點沉積物中AOB和AOA的amoA基因數(shù)量比較結(jié)果
在碧流河水庫庫區(qū)16個樣品中,兩個季節(jié)均含有大量amoA基因。根據(jù)圖2(a)得出,2014年10月秋季平水期樣品沉積物中AOB的amoA基因拷貝數(shù)在8.07×107~1.81×109拷貝數(shù)/克干土之間,而AOA的amoA基因拷貝數(shù)在2.12×107~8.92×108拷貝數(shù)/克干土之間,AOB的amoA基因拷貝數(shù)大于AOA,多出了1~2個數(shù)量級,秋季平水期不同采樣點之間的AOB和AOA的豐度的差異很大。從圖1(b)得出,2015年4月春季枯水期樣品沉積物中AOB的amoA基因拷貝數(shù)在1.13×108~1.18×109拷貝數(shù)/克干土之間,而 AOA 的amoA基因拷貝數(shù)在3.58×107~1.01×108拷貝數(shù)/克干土之間,AOB的amoA基因拷貝數(shù)明顯多于AOA,同樣多出了1~2個數(shù)量級,春季枯水期不同采樣點之間的AOB和AOA的豐度的差異也很大??傮w來看,沉積物中AOB的豐度大于AOA,在碧流河水庫庫區(qū)沉積物氨氧化過程中更占優(yōu)勢,先前的研究表明在很多環(huán)境中AOB多于AOA,在紅樹林沉積物、河流沉積物和氨氮污染的濕地(潮灘)[8]中,AOB更有優(yōu)勢,與此次實驗研究結(jié)果一致。兩個季節(jié)AOB豐度最高值出現(xiàn)在氨氮濃度高的庫區(qū)下游地帶。
圖3 2014年10月和2015年4月同一采樣點底泥沉積物中AOB和AOA的amoA基因數(shù)量比較結(jié)果
由圖3可以看出,2014年10月秋季沉積物樣品中的AOB的豐度普遍高于2015年4月春季樣品的,2014年10月庫區(qū)沉積物中AOA的豐度普遍低于2015年4月,總體來看,AOB的豐度增加的同時AOA豐度減少了,這也更加證明了AOB和AOA存在競爭關(guān)系。實驗中,AOA和AOB的豐度對于季節(jié)的變化并不明顯,表明了AOA和AOB的豐度對于兩個時期水庫環(huán)境的改變適應性很強。
運用皮爾森相關(guān)性分析的是每個地點的AOA和AOB豐度與環(huán)境因素的之間相關(guān)性。結(jié)果見表4:AOB的豐度與溫度呈顯著的負相關(guān)性,而與水深、有機質(zhì)、氨氮、亞硝氮均呈正相關(guān)性;AOA的豐度隨著硝氮的升高而降低。
近些年來,很多科學家探索了pH對于AOA和AOB豐度的影響,該課題得出的結(jié)論是pH與AOB和AOA的相關(guān)性不大,可能是因為采樣點pH差異不大導致的。實驗發(fā)現(xiàn)AOB的豐度與氨氮呈一定的正相關(guān)性,而AOA的豐度隨氨氮濃度升高而降低。亞硝氮與氨氮類似,是氨氧化過程的反應基質(zhì),大多數(shù)情況下,正如實驗中研究發(fā)現(xiàn)一樣,亞硝氮對于AOB呈正相關(guān)性。
表4 AOB和AOA豐度和環(huán)境因素的相關(guān)性分析
研究發(fā)現(xiàn),水深對AOB呈正相關(guān),隨著深度的增加,氧的含量越少,AOB對氧的競爭能力越差。之前研究表明AOB豐度隨著水深的增加而減少[9],而此次實驗得到的結(jié)果卻是相反的,可能是由于其他環(huán)境因素影響導致的。有機質(zhì)對AOB呈正相關(guān),但是與AOA呈負相關(guān),可能是因為其他環(huán)境因素對AOA共同影響導致的。
1)碧流河水庫庫區(qū)沉積物中含有大量氨氧化微生物,AOB的豐度大于AOA,說明AOB在碧流河水庫庫區(qū)沉積物氨氧化過程中更占優(yōu)勢,也充分說明了AOB對于碧流河水庫庫區(qū)沉積物的適應性更強。2014年10月秋季沉積物中的AOB的豐度高于2015年4月春季樣品的,而2014年10月秋季沉積物中AOA的豐度少于2015年4月春季樣品的,總體來看AOB豐度增加的同時AOA減少了。
2)AOA和AOB的豐度受環(huán)境因素的影響不同,AOB與溫度呈一定的負相關(guān)性,而與水深、有機質(zhì)、氨氮、亞硝氮均呈一定的正相關(guān)。AOA與硝氮呈顯著的負相關(guān)。表明兩個時期的樣品中AOA和AOB的豐度受到多個環(huán)境因素的共同影響且受到的主要環(huán)境影響因素不一致。
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