李 雪

（1.遼寧省鞍山水文局，遼寧鞍山 114039；2.大連理工大學(xué)，遼寧大連 116024）

0 引言

氨氧化微生物主要包括氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA），是氨氧化過程中起主要作用的角色，氨氧化過程是硝化反應(yīng)中一個環(huán)節(jié)，而硝化作用又是氮循環(huán)過程中關(guān)鍵的步驟，所以，氨氧化微生物的研究對更好地了解氮循環(huán)至關(guān)重要。硝化反應(yīng)的實質(zhì)就是在微生物的作用下，將氨氮轉(zhuǎn)化為硝氮的過程。在氨氧化過程中，氨單加氧酶基因（amoA）編碼的酶起至關(guān)重要的作用[1]，人們一直認(rèn)為只有氨氧化細(xì)菌含有這種基因，直到海洋中分離出來了第一株泉古菌，人們才意識到了不是只有氨氧化細(xì)菌才有這種功能。逐漸的，氨氧化古菌被人們認(rèn)為存在于多種生境中。多年以來，關(guān)于AOB、AOA在各種生境中的豐度得到了深入而廣泛的研究。Wang[2]等人在對水庫沉積物和鄰近土壤進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)AOA最高豐度依次出現(xiàn)在無植被生長的河邊土壤、水庫沉積物、種植蘆葦?shù)暮舆呁寥篮娃r(nóng)田土壤。Liu等人發(fā)現(xiàn)在三峽水庫好氧缺氧交替進(jìn)行的條件下，AOA更適應(yīng)生存[3]。

當(dāng)前對于淡水生境例如飲用水水庫沉積物中在氮循環(huán)中起作用的微生物的研究較少，碧流河水庫是大連市重要的水源工程，由于水庫水土流失嚴(yán)重，每一年都有大量的氮、磷、鉀、農(nóng)藥等隨著泥沙流入該水庫，有潛在的可能會破壞水庫中氮循環(huán)的平衡，甚至?xí)斐伤w富營養(yǎng)化。為了掌握水庫氮循環(huán)及氮代謝情況和維持生態(tài)穩(wěn)定，本課題主要針對遼寧省大連市碧流河水庫庫區(qū)沉積物中參與氮循環(huán)的微生物AOA和AOB的豐度進(jìn)行研究，探究在不同的環(huán)境條件影響下秋季平水期和春季枯水期水庫沉積物中AOA和AOB豐度的變化情況。

1 概述

AOB是氨氧化過程中起關(guān)鍵作用的微生物，屬于變形菌的β和γ亞綱。AOB的存在范圍可分為淡水沉積物、污水、土壤和海洋4個生態(tài)類群。為了維持各類生態(tài)系統(tǒng)的平衡，環(huán)境因子對AOB影響已被廣泛研究。銨作為AOB的底物，與AOB的豐度有著密切的聯(lián)系，AOB的豐度與銨的濃度呈正相關(guān)[4]。AOB的豐度受pH的影響，季節(jié)的改變和降雨的多少也會改變pH和AOB的相關(guān)性。pH較低時，銨被轉(zhuǎn)化為氨，改變底物濃度，從而改變AOB的豐度[4]。溫度對AOB豐度的影響，要根據(jù)實際的情況來分析。生物酶要求合適的溫度才能發(fā)揮作用，不同物種往往有其最適生長溫度，所以溫度變化會影響AOB豐度。深度對沉積物中AOB的豐度影響顯著，可能與其不同深度溶解氧不同有關(guān)，氧的可利用性對于海洋、湖泊、土壤和沉積物等各類生境中AOB豐度及其重要。微生物能分解有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)腐殖質(zhì)的形成，一般來說，水生系統(tǒng)中微生物的數(shù)量與有機(jī)質(zhì)的含量呈正相關(guān)。

AOA在土壤、淡水、沉積物等各類生態(tài)環(huán)境中被廣泛關(guān)注，并在自然界中起到了關(guān)鍵作用。近年來，微生物學(xué)一個顯著的成就就是發(fā)現(xiàn)了常溫型泉古菌中的一個功能類群—氨氧化古菌。AOA在銨濃度低時更加活躍，AOA適宜生長的溫度比較寬泛，在低溫或者非常高的溫度環(huán)境下，AOA的分布比較廣泛。在多數(shù)土壤環(huán)境中，當(dāng)pH值低至3.7時，AOA比AOB更占優(yōu)勢，AOA的豐度隨著pH的升高而降低[5]。

2 實驗方法

該課題研究的沉積物樣品分別取自2014年10月秋季平水期和2015年4月春季枯水期的碧流河水庫庫區(qū)，主要對碧流河水庫上游、中游和下游的10個不同地點進(jìn)行取樣。

2.1 沉積物樣品理化指標(biāo)的測定

對實驗樣品主要測的指標(biāo)有：溫度、氨氮、水深、硝氮、亞硝氮、pH值、有機(jī)質(zhì)。取一部分沉積物樣品，在50℃的條件下烘干后研磨，并用1 mm篩濾過。濾過的烘干土樣用飽和氯化鉀溶液處理，然后采用納氏試劑光度法和離子色譜測其氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量，采用PHS-25型酸度計測其pH值，利用重鉻酸鉀氧化法測定有機(jī)質(zhì)含量。

2.2 沉積物中amoA基因定量分析實驗

1）沉積物樣品的DNA提取與檢測

利用土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒來提取沉積物樣品的DNA，提取的DNA濃度以及純度用微量分光光度計測定。

2）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的培養(yǎng)與定量

首先選取含有AOB和AOA的沉積物，提取DNA，然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、割膠回收、鏈接克隆挑菌，把挑出的菌放到培養(yǎng)基里培養(yǎng)，之后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，最后用儀器超微量紫外分光光度計測定提取的質(zhì)粒的濃度和純度，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)的計算公式如下[6]：

6.02×1023（拷貝數(shù)/mol）×濃度（g/ml）/MV（g/mol）=拷貝數(shù)/ml

其中，MV=3 000 bp×660 dalton/bp=1.98×106daltons

最后把提取的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒放到-20℃的條件下保存用于接下來的實驗。

3）AOB和AOA的amoA基因熒光定量分析實驗

用定量反應(yīng)的試劑和引物[7]以及提取好的質(zhì)粒做AOB和AOA的定量實驗,定量反應(yīng)均在定量分析儀上進(jìn)行，熒光定量反應(yīng)引物及反應(yīng)條件見表1、反應(yīng)組分見表2，最后對熒光定量實驗的最終數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確的分析，從而得出AOB和AOA的拷貝數(shù)。

表1 實驗使用的引物和反應(yīng)條件

表2 熒光定量實驗反應(yīng)組分（AOA和AOB）

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法

實驗主要利用軟件統(tǒng)計產(chǎn)品與服務(wù)解決方案（SPSS）中的皮爾森相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)方法分析AOA和AOB豐度和沉積物理化因子之間的關(guān)系。

3 庫區(qū)沉積物氨氧化微生物豐度研究

3.1 沉積物理化指標(biāo)性質(zhì)初步研究

水庫沉積物對水庫水質(zhì)有重要影響，并且氨氧化微生物的生長和豐度有可能受到沉積物環(huán)境因素的影響，所以了解沉積物所處的環(huán)境條件有助于更好地分析沉積物中AOA和AOB的豐度受環(huán)境因子影響的變化情況。課題選取的是碧流河水庫庫區(qū)沉積物，2個時期各個采樣點的詳細(xì)資料和理化指標(biāo)見圖1。

圖1 碧流河水庫庫區(qū)8個采樣點的理化性質(zhì)

實驗中各個采樣點分別來自碧流河水庫庫區(qū)上中下游不同位置。從圖1中可知沉積物中亞硝氮的含量較低，可以忽略。2個季節(jié)沉積物中的氨氮含量均為下游最多，中游次之，上游最少，硝氮的濃度都很低。同一個季節(jié)，不同采樣點水深、氨氮和有機(jī)質(zhì)3個環(huán)境因子差異較大，而其他的環(huán)境因子之間的差異較??；同一個采樣點，不同季節(jié)溫度和氨氮2個環(huán)境因子差異較大，而其他的環(huán)境因子之間的差異較小。

3.2 沉積物中AOB和AOA的基因定量分析實驗

3.2.1 沉積物的DNA提取結(jié)果與分析

各個樣品提取的DNA的濃度在13.1～28.5 ng/μl，純度較高。

3.2.2 沉積物中AOB和AOA的amoA基因定量結(jié)果分析

分別對AOA和AOB的amoA基因的質(zhì)粒進(jìn)行1∶5的等梯度稀釋，用稀釋得到的5個標(biāo)準(zhǔn)點繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在實驗中得到R2≥0.98的標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的詳細(xì)結(jié)果見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性良好。

表3 AOA和AOB的amoA基因熒光定量實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

圖2 采樣點沉積物中AOB和AOA的amoA基因數(shù)量比較結(jié)果

在碧流河水庫庫區(qū)16個樣品中，兩個季節(jié)均含有大量amoA基因。根據(jù)圖2（a）得出，2014年10月秋季平水期樣品沉積物中AOB的amoA基因拷貝數(shù)在8.07×107～1.81×109拷貝數(shù)/克干土之間，而AOA的amoA基因拷貝數(shù)在2.12×107～8.92×108拷貝數(shù)/克干土之間，AOB的amoA基因拷貝數(shù)大于AOA，多出了1～2個數(shù)量級，秋季平水期不同采樣點之間的AOB和AOA的豐度的差異很大。從圖1（b）得出，2015年4月春季枯水期樣品沉積物中AOB的amoA基因拷貝數(shù)在1.13×108～1.18×109拷貝數(shù)/克干土之間，而 AOA 的amoA基因拷貝數(shù)在3.58×107～1.01×108拷貝數(shù)/克干土之間，AOB的amoA基因拷貝數(shù)明顯多于AOA，同樣多出了1～2個數(shù)量級，春季枯水期不同采樣點之間的AOB和AOA的豐度的差異也很大?？傮w來看，沉積物中AOB的豐度大于AOA，在碧流河水庫庫區(qū)沉積物氨氧化過程中更占優(yōu)勢，先前的研究表明在很多環(huán)境中AOB多于AOA，在紅樹林沉積物、河流沉積物和氨氮污染的濕地(潮灘)[8]中，AOB更有優(yōu)勢，與此次實驗研究結(jié)果一致。兩個季節(jié)AOB豐度最高值出現(xiàn)在氨氮濃度高的庫區(qū)下游地帶。

圖3 2014年10月和2015年4月同一采樣點底泥沉積物中AOB和AOA的amoA基因數(shù)量比較結(jié)果

由圖3可以看出，2014年10月秋季沉積物樣品中的AOB的豐度普遍高于2015年4月春季樣品的，2014年10月庫區(qū)沉積物中AOA的豐度普遍低于2015年4月，總體來看，AOB的豐度增加的同時AOA豐度減少了，這也更加證明了AOB和AOA存在競爭關(guān)系。實驗中，AOA和AOB的豐度對于季節(jié)的變化并不明顯，表明了AOA和AOB的豐度對于兩個時期水庫環(huán)境的改變適應(yīng)性很強(qiáng)。

3.3 沉積物中AOB和AOA的豐度與環(huán)境因素之間的相關(guān)性分析

運用皮爾森相關(guān)性分析的是每個地點的AOA和AOB豐度與環(huán)境因素的之間相關(guān)性。結(jié)果見表4：AOB的豐度與溫度呈顯著的負(fù)相關(guān)性，而與水深、有機(jī)質(zhì)、氨氮、亞硝氮均呈正相關(guān)性；AOA的豐度隨著硝氮的升高而降低。

近些年來，很多科學(xué)家探索了pH對于AOA和AOB豐度的影響，該課題得出的結(jié)論是pH與AOB和AOA的相關(guān)性不大，可能是因為采樣點pH差異不大導(dǎo)致的。實驗發(fā)現(xiàn)AOB的豐度與氨氮呈一定的正相關(guān)性，而AOA的豐度隨氨氮濃度升高而降低。亞硝氮與氨氮類似，是氨氧化過程的反應(yīng)基質(zhì)，大多數(shù)情況下，正如實驗中研究發(fā)現(xiàn)一樣，亞硝氮對于AOB呈正相關(guān)性。

表4 AOB和AOA豐度和環(huán)境因素的相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)，水深對AOB呈正相關(guān)，隨著深度的增加，氧的含量越少，AOB對氧的競爭能力越差。之前研究表明AOB豐度隨著水深的增加而減少[9]，而此次實驗得到的結(jié)果卻是相反的，可能是由于其他環(huán)境因素影響導(dǎo)致的。有機(jī)質(zhì)對AOB呈正相關(guān)，但是與AOA呈負(fù)相關(guān)，可能是因為其他環(huán)境因素對AOA共同影響導(dǎo)致的。

4 結(jié)語

1）碧流河水庫庫區(qū)沉積物中含有大量氨氧化微生物，AOB的豐度大于AOA，說明AOB在碧流河水庫庫區(qū)沉積物氨氧化過程中更占優(yōu)勢，也充分說明了AOB對于碧流河水庫庫區(qū)沉積物的適應(yīng)性更強(qiáng)。2014年10月秋季沉積物中的AOB的豐度高于2015年4月春季樣品的，而2014年10月秋季沉積物中AOA的豐度少于2015年4月春季樣品的，總體來看AOB豐度增加的同時AOA減少了。

2）AOA和AOB的豐度受環(huán)境因素的影響不同，AOB與溫度呈一定的負(fù)相關(guān)性，而與水深、有機(jī)質(zhì)、氨氮、亞硝氮均呈一定的正相關(guān)。AOA與硝氮呈顯著的負(fù)相關(guān)。表明兩個時期的樣品中AOA和AOB的豐度受到多個環(huán)境因素的共同影響且受到的主要環(huán)境影響因素不一致。

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