付文靜，王家林，張杰

（青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島266042）

納豆是一種以黃豆為主要原料，蒸煮后經(jīng)過(guò)納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成的古老豆制食品，在日本，食用納豆的歷史已長(zhǎng)達(dá)兩千多年[1]。納豆中含有豐富的功能物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近幾年來(lái)成為微生態(tài)食品的研究熱點(diǎn)[2]。納豆中的納豆激酶，具有較強(qiáng)的纖溶活性，可以幫助治療血栓類疾病，降低心腦血管疾病的發(fā)病率，穩(wěn)定血壓，溶解血栓，有望成為新型溶栓制劑[3]，納豆中含有較高含量的維生素K2，可增加骨密度，預(yù)防骨質(zhì)疏松，納豆中還含有染料木素和胰蛋白酶抑制劑，能夠抗菌消炎，防毒防癌[4]。赤小豆俗稱紅豆，廣泛種植于我國(guó)各地，赤小豆含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及VA1、VB1、VB2等功能物質(zhì)，具有清熱解毒、減肥消腫、健脾利濕、消積化瘀等療效，經(jīng)過(guò)蒸煮的赤小豆香糯可口，色澤鮮亮，深受人們的喜愛(ài)[5]。雖然納豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，但國(guó)人很難接受制作納豆時(shí)由于腐敗而產(chǎn)生的氨臭味[6]，導(dǎo)致納豆食品在我國(guó)消費(fèi)群體中尚未普及，很多人對(duì)納豆敬而遠(yuǎn)之。所以，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)納豆發(fā)酵底物黃豆中添加一定量赤小豆，嘗試改變傳統(tǒng)納豆的風(fēng)味，以納豆激酶的活性及感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)進(jìn)行分析，提高納豆產(chǎn)品的質(zhì)量，改善納豆口味，開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品，促進(jìn)納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、赤小豆：顆粒飽滿，形態(tài)完整，均購(gòu)自青島市利群超市；納豆芽孢桿菌：青島科技大學(xué)生物工程試驗(yàn)室保藏菌種；纖維蛋白原（分析純）：美國(guó)Sigma公司；凝血酶（分析純）：山東日照海峰制藥有限公司；酪蛋白（分析純）：甘南州科瑞乳品開(kāi)發(fā)有限公司；尿激酶（分析純）：青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)（LG10-2.4A）：北京京立離心機(jī)有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-18SI）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 培養(yǎng)基

酪素培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，酪素5 g，葡萄糖1 g，酵母膏 1 g，K2HPO41 g，KH2PO40.5 g；pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌30 min。

LB 培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每試管分裝 2 mL，0.1 MPa滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 5 g，蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每個(gè)三角瓶分裝200 mL，0.1 MPa滅菌30 min。

1.4 方法

1.4.1 納豆芽孢桿菌的活化及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將試驗(yàn)室保藏菌株在斜面培養(yǎng)基活化24 h，用接種環(huán)小心挑取單菌落，轉(zhuǎn)接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，裝液量為40 mL/250 mL，于37℃、180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)，每隔3小時(shí)取種子液，用分光光度計(jì)測(cè)其OD660數(shù)值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，所測(cè)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，即為納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線[7]。

1.4.2 指標(biāo)評(píng)定

1.4.2.1 納豆激酶活性的測(cè)定

納豆激酶酶活的具體測(cè)定方法是采用了改進(jìn)的纖維蛋白平板法，尿激酶與納豆激酶具有相似的纖溶活性，當(dāng)凝血酶與血纖維蛋白原作用后，會(huì)產(chǎn)生凝固狀的交聯(lián)血纖維蛋白，此時(shí)再加入納豆激酶或尿激酶溶液，納豆激酶或尿激酶就會(huì)作用于交聯(lián)血纖維蛋白，使其溶解[8]。

在采用傳統(tǒng)的平板法測(cè)酶活時(shí)，形成的透明圈往往形狀不均，呈不規(guī)則的圓形，無(wú)法直觀的測(cè)量透明圈面積，所以，本試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，依照平板法的制作方法[9]，在比色皿內(nèi)，加入一定比例的纖維蛋白原和凝血酶，制成微型纖維平板，然后在每個(gè)比色皿內(nèi)加入配置成的不同濃度梯度（125、250、500、1 000、2 000 U）的標(biāo)準(zhǔn)尿激酶。在纖維平板形成反應(yīng)開(kāi)始的2 h之間，每隔30分鐘測(cè)定一次OD655值；計(jì)算出在每個(gè)時(shí)間內(nèi)的OD655值同初始OD655值的差值ΔOD655。利用最小二乘法算出直線的斜率ΔOD655/h。用計(jì)算所得斜率同尿激酶濃度的對(duì)數(shù)作圖，便可得到相對(duì)應(yīng)的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取不同發(fā)酵條件下的樣品納豆激酶粗酶液10 μL，點(diǎn)樣于比色皿內(nèi)微型纖維平板上，按照相同的方法進(jìn)行測(cè)定其吸光度減少值，參照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可比較不同樣品納豆激酶的酶活。

1.4.2.2 感官評(píng)定

隨機(jī)選取10名青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院志愿者，按照感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表對(duì)赤小豆納豆產(chǎn)品進(jìn)行打分，分值從0至10分不等。納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of natto

1.4.3 工藝流程

按照以下流程對(duì)赤小豆納豆進(jìn)行單因素和正交發(fā)酵試驗(yàn)。

大豆、赤小豆→精選→清洗→浸泡→蒸煮→接種→發(fā)酵→后熟→成品[10]

1.4.3.1 操作要求

大豆、赤小豆選擇：精選顆粒飽滿、色澤鮮亮的大豆、赤小豆，無(wú)沙粒等雜質(zhì)，用清水洗凈；浸泡：過(guò)夜浸泡14 h～16 h，水與大豆以質(zhì)量比1∶3的比例進(jìn)行浸泡；蒸煮：高溫高壓滅菌鍋中于121℃蒸煮30 min，蒸煮豆子至綿軟；接種菌液：以3%的接種量進(jìn)行接種；待豆子冷卻到50℃左右接種；發(fā)酵：按照試驗(yàn)設(shè)定條件（不同發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、赤小豆與大豆的原料比）進(jìn)行發(fā)酵；后熟：于4℃左右條件下后熟24 h。

1.4.3.2 單因素試驗(yàn)

研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、原料比對(duì)赤小豆納豆的影響。即保持其中兩個(gè)因素不變，改變另一個(gè)因素，研究該因素的變化對(duì)納豆激酶酶活及感官評(píng)價(jià)的影響。分別在發(fā)酵溫度為 30、34、38、42、46 ℃；發(fā)酵時(shí)間為 10、14、18、22、26 h；赤小豆與黃豆質(zhì)量比為 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5（共 50 g）的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，每項(xiàng)因素進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值記錄，以納豆激酶產(chǎn)量和感官評(píng)價(jià)的加權(quán)分值為指標(biāo)進(jìn)行分析。

綜合分?jǐn)?shù)=0.5×（納豆激酶酶活/納豆激酶酶活最大值）×10+0.5×（感官評(píng)分/感官評(píng)分最大值）×10

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以納豆激酶活性和感官評(píng)價(jià)的加權(quán)分值為指標(biāo)進(jìn)行工藝的優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

本試驗(yàn)所得菌種生長(zhǎng)曲線以培養(yǎng)時(shí)間（種齡）為橫坐標(biāo)，以吸光度OD660數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，可得菌種的生長(zhǎng)曲線，納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

由圖1可知，納豆芽孢桿菌在3 h～17 h時(shí)菌體濃度增長(zhǎng)十分緩慢，處于環(huán)境適應(yīng)期，生長(zhǎng)幾乎停滯；17 h～25 h時(shí)，在培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的條件下，菌體大量繁殖，菌體濃度呈指數(shù)上升狀態(tài)；25 h～30 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，菌體開(kāi)始產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物；30 h后菌體處于衰亡期，此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，甚至被消耗殆盡，菌體數(shù)目減少。因此，綜合比較，選用種齡為23 h的芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)尿激酶曲線

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)尿激酶溶液加入微型纖維平板后在655 nm處的吸光度值，以尿激酶酶活對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，△OD655/h為縱坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)尿激酶曲線見(jiàn)圖2?；貧w方程為y=0.018 33x-0.036 7，R2=0.998 68。

圖2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve urokinase activity

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測(cè)定發(fā)酵溫度為 30、34、38、42、46 ℃時(shí)赤小豆納豆的感官評(píng)分及納豆激酶酶活，計(jì)算綜合分?jǐn)?shù)，發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on product quality

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，赤小豆納豆成品的感官評(píng)分和納豆激酶活性數(shù)值均為先升高，后降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為38℃時(shí)，感官評(píng)分和納豆激酶活性都是最高值。納豆芽孢桿菌處于最適溫度時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，其內(nèi)部各種酶代謝活躍，可充分發(fā)揮各自的功用，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)菌的代謝與增殖，降低其生理活性，溫度過(guò)高也可能引起納豆激酶失活，并且，溫度過(guò)高時(shí)，納豆色澤暗淡，形態(tài)癟軟，感官評(píng)價(jià)不佳，因此，確定38℃為赤小豆納豆發(fā)酵的最佳溫度。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測(cè)定發(fā)酵時(shí)間為 10、14、18、22、26 h 時(shí)赤小豆納豆的感官評(píng)分及納豆激酶酶活，計(jì)算綜合分?jǐn)?shù)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on product quality

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，赤小豆納豆成品的感官評(píng)分先升高，后降低，發(fā)酵時(shí)間為22 h時(shí)產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)最佳，此時(shí)的納豆色澤鮮亮，拉絲細(xì)長(zhǎng)黏稠，口感潤(rùn)滑；發(fā)酵時(shí)間過(guò)短時(shí)，無(wú)明顯的納豆香氣；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，豆類發(fā)酵積累的酸臭和氨味增加，影響感官評(píng)價(jià)。

而納豆激酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為10 h～18 h時(shí)，酶活急劇升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為18 h～26 h時(shí)，酶活升高不明顯。因此綜合感官評(píng)分和納豆激酶酶活，確定22 h為發(fā)酵時(shí)間的最佳值。

2.3.3 原料比對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測(cè)定赤小豆與黃豆質(zhì)量比為1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5∶5時(shí)赤小豆納豆的感官評(píng)分及納豆激酶酶活，計(jì)算綜合分?jǐn)?shù)，原料比對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖5所示。

圖5 原料比對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of feed ratios on product quality

由圖5可知，隨著赤小豆與黃豆的質(zhì)量比的不斷增大，產(chǎn)品感官評(píng)分先上升，后下降，在質(zhì)量比為2∶8處出現(xiàn)峰值，此時(shí)的赤小豆納豆顏色對(duì)比鮮明，秀色可餐。而相比之下，隨著赤小豆與大豆的質(zhì)量比不斷加大，產(chǎn)品的納豆激酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1∶9處最大，這可能是由于大豆中所含適合納豆菌發(fā)酵的底物營(yíng)養(yǎng)成分較高。綜合感官評(píng)價(jià)與納豆激酶活性的最終分?jǐn)?shù)，選取赤小豆∶黃豆=2∶8，即1∶4為最佳原料比。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 赤小豆納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and result for fermentation technology optimization of Phaseolus angularis natto

由表2中的數(shù)據(jù)可知，本試驗(yàn)選取的3個(gè)因素對(duì)赤小豆納豆的綜合評(píng)價(jià)影響力大小為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞原料比，通過(guò)k值比較可得，最優(yōu)組合為：發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間22h，赤小豆與納豆原料比2∶8。由于該組合在上述正交試驗(yàn)的組合中沒(méi)有出現(xiàn)，經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，與第2、5組試驗(yàn)相似，因此需要進(jìn)行追加試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

在發(fā)酵溫度為38℃，發(fā)酵時(shí)間為22 h，赤小豆與納豆原料比為2∶8時(shí)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵所得的赤小豆納豆感官評(píng)價(jià)較高，色澤、口感均佳，對(duì)其進(jìn)行納豆激酶酶活的測(cè)定，酶活達(dá)942 U/g，優(yōu)于正交試驗(yàn)表中的任何一組試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，赤小豆納豆的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間22 h，赤小豆與黃豆質(zhì)量比為2∶8（即1∶4）。赤小豆納豆與傳統(tǒng)納豆相比，不僅拉絲明顯，保留了納豆細(xì)膩潤(rùn)滑的口感，而且具有赤小豆鮮艷明亮的色澤和香糯可口的品質(zhì)，其外觀顏色飽滿，品嘗起來(lái)細(xì)膩綿軟，氨味減少，香味增強(qiáng)，輕輕攪動(dòng)時(shí)，黏液多，拉絲程度高，經(jīng)測(cè)定，納豆激酶酶活可達(dá)942 U/g。

在傳統(tǒng)納豆中添加赤小豆所得的赤小豆納豆，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與口感均優(yōu)于傳統(tǒng)大豆納豆，口味較符合國(guó)人的飲食習(xí)慣。赤小豆納豆的研究與開(kāi)發(fā)，不僅有利于提高赤小豆、大豆的附加值，使資源得到有效地利用，而且有助于人們?cè)谙硎芪独俚耐瑫r(shí)改善飲食結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)國(guó)民體質(zhì)，滿足更多消費(fèi)者的需求，為納豆產(chǎn)業(yè)在中國(guó)的發(fā)展提供了新的思路。

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