施婭楠，和麗菊，趙存朝，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一種多年生木本植物，原產(chǎn)于印度西北部，具有生長速度快、耐高溫、耐旱的特點(diǎn)[1-4]，辣木以其高蛋白質(zhì)、低脂肪、高纖維素、維生素的健康特性和降血糖、抗菌消炎、強(qiáng)心的保健效果而成為健康食品界的新寵，2012年被中國綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定為“國家首推綠色食品”，如今在發(fā)展中國家廣泛種植[5-10]。辣木蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，葉中蛋白含量在27%～37%，其中約80%谷蛋白，14%醇溶蛋白，3.5%白蛋白和1%球蛋白[11]，因此，約90%以上的葉蛋白為非水溶性的谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白分子內(nèi)存在巰基和分子之間的二硫鍵，結(jié)構(gòu)決定其不溶于中性鹽溶液而只溶于稀酸、稀堿；醇溶蛋白疏水性較強(qiáng)，使得辣木蛋白在弱堿提、弱酸提或鹽溶后仍被保留在葉中[12]，因此，辣木蛋白溶解、乳化性能不佳等原因，多作為動物飼料使用，造成蛋白資源的極大浪費(fèi)[13]。酶法可破壞蛋白質(zhì)與其他非水溶性物質(zhì)結(jié)合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質(zhì)溶解性，并對其他功能特性產(chǎn)生一定的作用[14-18]。本研究從蛋白資源開發(fā)和辣木葉資源的充分利用兩方面考慮，開展從辣木葉渣中提取非水溶蛋白，旨在能將蛋白充分提取并適當(dāng)改性后，增強(qiáng)蛋白消化吸收性、以期加工成食用乳化劑、起泡劑、膠凝劑和多肽類產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

辣木葉粉：云南德宏州天佑科技開發(fā)有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、R-250、甘油、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED、Tris-Hcl、溴酚藍(lán)（分析純）、果膠酶（500 U/mg）、木聚糖酶（6 000 U/mg）、復(fù)合植物水解酶（200 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：Sigma公司；鹽酸（食品級）：北京化工試劑廠。

1.2 儀器

UV765PC紫外分光光度計(jì)、DHG-9070A真空冷凍干燥機(jī)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；超聲波萃取儀：上海力申科學(xué)儀器有限公司；Bio-rad 164-5052電泳儀：BIO-RAD；I99161pH計(jì)：納沃德儀器（北京）有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：海博訊實(shí)業(yè)有限公司；8-2磁力攪拌器：北京世紀(jì)陽光科技發(fā)展有限公司；XH微型漩渦混合器：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

辣木葉渣的制備為了最大可能地去除辣木葉水浸出物，去除水溶性蛋白質(zhì)，采用0.08 mol/L堿液提取，料液比1∶80（g/mL）提取浸提2次，每次超聲時間30 min，測蛋白含量，葉渣55℃烘干保存；葉渣在最適酶解條件下4℃渦旋振蕩10 min，真空濃縮至原10倍體積，加入濃縮液4倍體積的75%預(yù)冷乙醇溶液，-4℃沉淀過夜，真空冷凍干燥得辣木蛋白干粉（-20℃保藏）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以辣木葉渣蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，研究水解酶種類、酶用量、酶解溫度、時間4個因素變量。設(shè)置酶種類為果膠酶、復(fù)合植物水解酶、木聚糖酶、堿性蛋白酶；酶用量 0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃；酶解時間 40、50、60、70、80 min。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶的添加量、酶解時間、酶解溫度為試驗(yàn)因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木葉渣蛋白提取率的工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Level of experimental factors

1.3.4 蛋白質(zhì)提取率

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μ/g）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在波長595 nm處繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：

式中：C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；M為辣木葉渣質(zhì)量，g。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

1.3.5.1 制備樣品

分別取100 mg辣木葉蛋白質(zhì)干粉樣品溶解在100 mL，100 mmol/L，pH6.5的磷酸緩沖溶液中，加入0.1%的NaN3，低溫加熱，漩渦振蕩3 min使之溶解，離心（8 000 r/min，2 min），備用。

1.3.5.2 配制5×電泳緩沖液、固定液、染色液、脫色液等電泳使用相關(guān)溶液

將配置好的樣品和上樣緩沖液混合，按樣品：載樣液=4∶1（體積比）的比例配制成1 mL的溶液后搖勻，沸水浴加熱10 min制得電泳樣，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.3 配膠

取綠色夾板固定薄厚玻璃板，支架固定好夾板，準(zhǔn)備裝分離膠和濃縮膠（預(yù)試驗(yàn)確定分離膠濃度為15%），制備分離膠時小心避免產(chǎn)生氣泡，迅速在膠上部加超純水，使凝膠表面變得平整，待膠凝固30 min，棄去水層用濾紙將多余的水吸干，灌注濃縮膠，直至凝膠溶液達(dá)到玻璃板的頂端，立即插入梳子，待膠凝固30min。

1.3.5.4 電泳

移液槍小心將蛋白marker、電泳樣依此加入到凹槽內(nèi)，加入適量的5×電泳緩沖液，鏈接電源，設(shè)定濃縮膠電泳條件為50 V恒壓30 min，分離膠電泳條件為120 V恒壓約1 h，等溴酚藍(lán)跑至凝膠底部，關(guān)閉電源。

1.3.5.5 電泳膠片的處理

電泳結(jié)束，取下膠片，依次對電泳膠片進(jìn)行固定、染色、脫色、掃描分析。

固定：電泳結(jié)束，將電泳膠片從夾板上取出，切去濃縮膠后，放入30%的乙醇溶液中固定30 min。染色：將固定好的膠片，轉(zhuǎn)移到考馬斯亮藍(lán)G-250染液中染色，放置于搖床上均勻染色，5 h。脫色：染色結(jié)束后，用20%的甲醇或超純水進(jìn)行脫色，多次洗脫至條帶清晰可見。掃描：將脫色后的膠，放在掃描儀上掃描，放膠時注意避免產(chǎn)生氣泡。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取工藝參數(shù)

2.1.1 酶種類對蛋白提取率的影響

不同水解酶對辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸妶D1。

圖1 不同種類酶對殘?jiān)鞍滋崛÷实挠绊慒ig.1 The effect of enzyme species on the residual protein extraction rate

由圖1可知，不同水解酶對辣木葉渣蛋白質(zhì)提取率的影響：堿性蛋白酶>木聚糖酶＞復(fù)合植物水解酶＞果膠酶，由于不同種類的水解酶的作用于蛋白質(zhì)的機(jī)理和酶催化動力學(xué)特征不同導(dǎo)致提取效果有明顯不同。堿性蛋白酶的提取效果在所選4種酶制劑中最好，提取率達(dá)36.4（mg/g），辣木葉中多糖含量極高，堿性蛋白酶可使葉渣中多糖結(jié)構(gòu)變得松散，對蛋白質(zhì)和多糖的分離起到了促進(jìn)作用[17]，同時堿性蛋白酶是一種內(nèi)切肽酶，能夠水解多種蛋白，提取率相對較高，且售價合理。所以，本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量對蛋白提取率的影響

酶添加量對辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸妶D2。

圖2可知，堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）時，提取率達(dá)34.7（mg/g）。隨著酶用量的增加，提取率反而下降，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)受到酶的過度水解，空間結(jié)構(gòu)受到破壞，與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合的疏水區(qū)減少，所以酶用量提高而蛋白提取率下降。同時，把已水解的蛋白質(zhì)水解成更小的肽[20]，而蛋白質(zhì)含量并沒有增加，提取率反而降低。

圖2 酶添加量對殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊慒ig.2 The effect of enzyme dosage on the residual protein extraction rate

2.1.3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

酶解溫度對辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸妶D3。

圖3 酶解溫度對殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊慒ig.3 The effect of enzyme hydrolysis temperature on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）的條件下提取蛋白質(zhì)，該酶理論最適作用溫度為50℃～60℃，由圖3可知，本試驗(yàn)最適作用溫度為55℃，溫度繼續(xù)升高時，酶活性降低，蛋白提取率降低，當(dāng)溫度高于55℃，尤其是具有催化活性的四級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，易變性，同時由于疏水基團(tuán)的暴露和展開、蛋白質(zhì)分子的聚集，使葉渣中的蛋白質(zhì)溶解度下降，導(dǎo)致酶提時蛋白質(zhì)提取率下降[12]。

2.1.4 酶解時間對蛋白提取率的影響

酶解時間對蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對殘?jiān)鞍滋崛÷实挠绊慒ig.4 The effect of enzyme hydrolysis time on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S），酶解溫度55℃的條件提取蛋白質(zhì)，由圖4可知，提取的時間越長，提取率越高，在60 min～70 min內(nèi)，增長速率很快；當(dāng)時間達(dá)到70 min后，隨著時間的延長，蛋白質(zhì)的提取率變化不大，且緩慢減低，蛋白酶催化植物蛋白質(zhì)水解時是通過催化肽鍵的斷裂來發(fā)揮作用的，其作用于肽鏈內(nèi)部的肽鍵，生成長度較短的多肽鏈，使得大分子蛋白的質(zhì)量降低，得到小分子蛋白[16]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木蛋白的提取率參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到辣木蛋白提取率對X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方差分析表。模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

利用Design-Expert 8.06軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到蛋白質(zhì)提取率X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方程為：蛋白提取率Y=36.63-0.35X1-0.53X2-1.08X3-0.20X1X2+0.12X1X3-0.35X2X3-4.22X12-1.87X22-3.68X32。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

從方差分析可以看出，回歸模型F=174，97，P＜0.01，表明二次多元回歸模型顯著；失擬項(xiàng)F=0.78，P=0.560 3＞0.05，模型失擬不顯著，說明未知因素對結(jié)果的影響非常小，試驗(yàn)誤差主要來源于隨機(jī)誤差?；貧w診斷表明，決定系數(shù)R2=0.439 5，信噪比Adeq precisior=24.326。這表明方程的擬合和可信度高，可用于預(yù)測辣木中可溶性蛋白的提取。CV（Y變異系數(shù)）表示試驗(yàn)本身的精度，CV值越小，試驗(yàn)的可靠性越高，本試驗(yàn)中CV比較低，為0.28%，表明試驗(yàn)操作的可信度高，具有實(shí)用性指導(dǎo)意義。通過回歸系數(shù)的絕對值分析了每個因素對辣木蛋白提取變化的影響，檢驗(yàn)可知：X22的影響顯著（P＜0.01），X12，X32的影響極顯著（P＜0.001）。據(jù)F值可知，各個因素對辣木蛋白的提取率影響的大小順序?yàn)椋篨3酶解溫度＞X1酶的添加量＞X2酶解時間。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）可以通過觀察圖5中的響應(yīng)面的變化和輪廓線的稀疏度來衡量蛋白提取率的影響。當(dāng)輪廓為圓形時，兩個因素之間的相互作用不顯著，而橢圓形或鞍形形狀顯示兩個因素之間的相互作用是顯著的。各因素交互作用對辣木蛋白提取影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5可以表明：交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3影響極顯著（P＜0.01）。而且 X1、X2、X3之間的相互作用的變化是陡峭的，表明每個因素對辣木提取率的影響大，與方差分析一致。其中等高線呈名的橢圓形和馬蹄形，說明這4個因數(shù)的相互作用是顯著的，對辣木蛋白的提取率影響較大。

圖5 各因素交互作用對辣木蛋白提取影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph interactive effects of various factors on the protein extract of Moringa oleifera

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

通過響應(yīng)面法得到辣木葉渣中蛋白的最佳提取工藝為堿性蛋白酶添加量1.4%，酶解溫度為54.5℃，酶解時間為68.4 min，此條件提取率為（35.88±1.73）mg/g。實(shí)際操作中稍作調(diào)整確定的最佳工藝條件為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時間為70 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蛋白提取率為（34.92±1.42）mg/g與理論值接近，說明模型與實(shí)際相符，具有實(shí)際應(yīng)用的價值。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

辣木葉總蛋白質(zhì)在非還原條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖6，酶解后蛋白電泳圖譜見圖7。

圖6 總蛋白的電泳圖Fig.6 Electrophoresis profiles of total proteins

酶解前在高分子區(qū)域有25 KD～100 KD蛋白譜帶，其中55 KD～100 KD屬于高分子量醇溶蛋白，75%預(yù)冷乙醇條件下部分醇溶蛋白被提取出來[22-23]。25 KD～55 KD譜帶為低分子量谷蛋白，其中25 KD～30 KD，55 KD為主要辣木葉谷蛋白，0.08 mol/L堿液可以將此部分蛋白提取出來，圖6區(qū)域顯示的蛋白可能是通過分子間二硫鍵交鏈形成的，使得這部分蛋白質(zhì)在水或0.15 M氯化鈉提取過程中不能溶出[22-23]。

酶解條件下的凝膠電泳條帶見圖7。

圖7 酶解后蛋白電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis profiles of the protein after enzymatic hydrolysis

通過添加量為1.8%的堿性蛋白酶，辣木葉中非水溶性蛋白在酶解過程中發(fā)生降解，形成分子在15 KD以下的小分子蛋白，其原因是，酶法可破壞蛋白質(zhì)與其他非水溶性物質(zhì)結(jié)合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質(zhì)溶解性，并且降解成為原先不存在的小分子蛋白。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析法建立辣木葉渣中非水溶性蛋白提取的二次回歸模型，建立的最佳參數(shù)為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時間70 min，提取率為（34.92±1.42）mg/g。電泳結(jié)果顯示疏水作用、二硫鍵連同其它形式的共價鍵共同作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集導(dǎo)致溶解性降低，酶解后蛋白質(zhì)高分子量亞基的谷蛋白和醇溶蛋白基本消失，在低分子區(qū)域形成15 KD以下的蛋白譜帶。

[1]吳頔,蔡志華,魏燁昕,等.辣木作為新型植物性蛋白質(zhì)飼料的研究進(jìn)展[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2013,25(3):503-511

[2]初雅潔,符史關(guān),龔加順,等.云南不同產(chǎn)地辣木葉成分的分析比較[J].食品科學(xué),2016,37(2):160-164

[3]劉子記,孫繼華,劉昭華,等.特色植物辣木的應(yīng)用價值及發(fā)展前景分析[J].熱帶作物學(xué)報,2014,35(9):1871-1878

[4]劉昌芬,李國華.辣木的營養(yǎng)價值[J].熱帶農(nóng)業(yè)科技,2004,27(1):4-7

[5]楊東順,樊建麟,邵金良,等.辣木不同部位主要營養(yǎng)成分及氨基酸含量比較分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(9):1110-1115

[6]Saint Sauveur A D.Moringa,a multipurpose tree for the Sahel[J].Physiologie des arbres et arbustes en zones,1993,10(7):98-101

[7]Olson M E,Fahey J W.Moringa oleifera:a multipurpose tree for the dry tropics[J].Revista Mexicana De Biodiversidad,2011,82:1071-1082

[8]Horwath M,Benin V.Theoretical investigation of a reported antibiotic from the“Miracle Tree”Moringa oleifera[J].Comput Theor Chem,2011,965:196-201

[9]Makkar H P S,Becker K.Nutrients and antiquality factors in different morphological parts of the Moringa oleifera tree[J].J Agr Sci,1997,128:311-322

[10]Palada M C.Moringa(Moringa oleifera Lam):a versatile tree crop with horticultural potential in the subtropical United States[J].Hortscience,1996,31:794-797

[11]Makkar H P S,Becker K.Nutrional value and antinutritional components of whole and ethanol extracted Moringa oleifera,leaves[J].Animal Feed Science&Technology,1996,63(1/4):211-228

[12]王文高,陳正行,姚惠源,等.不同蛋白酶提取大米蛋白質(zhì)的研究[J].糧食與飼業(yè),2002(3):41-42

[13]李宏武.葡萄酒廠下腳料的綜合開發(fā)利用途徑[J].食品研究與開發(fā),2000(1):29-31

[14]楊建華.葡萄籽中提取油和蛋白質(zhì)的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2000(10):48-49

[15]李秀珍,張慧祥,羅玉潔,等.山葡萄籽蛋白的提取和分析[J].食品科學(xué),1989,10(8):20-21

[16]奚海燕,張暉.大米蛋白的提取及改性研究[D].無錫:江南大學(xué),2008(1):56-59

[17]張恒,柯澤偉,佘余輝,等.從野生蕎子提取蛋白質(zhì)和淀粉的研究[J].鄭州糧食學(xué)院學(xué)報,2002,21(1):36-38

[18]郝利平,郝林.黑大豆與扁豆活性蛋白質(zhì)提取工藝的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2002,18(3):117-119

[19]徐明生,上官新晨,吳少福,等.籽粒莧蛋白質(zhì)的提取研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2003,20(1):43-45

[20]祝婧,劉磊,張名位,等.不同分子量海鱸魚膠原蛋白肽組分的功能特性比較[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(12):113-118

[21]葉燕軍,陳俊,翁武銀,等.超濾膜分離魚內(nèi)臟酶解物及其體外抗氧化活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015,34(3):13-17

[22]Belton P S,Taylor J R N.Pseudocereals and Less Common Cereals[M].Springer:Berlin Heidelberg,2002:15-18,31

[23]Koh B K.Effect of cysteine on free radical production and protein modification in extruded wheat flour[J].Cereal Chem,1996,73(1):115-122