王 寧，于建光*，常志州，黃紅英，顧克軍，張振華

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院循環(huán)農(nóng)業(yè)研究中心，南京 210014)

在長江中下游地區(qū)，長期形成的稻麥輪作種植模式在保障主要糧食供應上功不可沒，可以預見該種植方式仍將長期存在；同時由于小麥收獲后秸稈產(chǎn)生量大以及茬口時間短、季節(jié)緊，秸稈還田作為有效的秸稈處置措施仍被廣泛采用。長期秸稈還田不僅能改善土壤結構，增加土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量[1-5]，而且對土壤微生物也有重要的影響[6]。然而由于傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法，如微生物平板培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等往往無法詳細描述出土壤微生物的群落多樣性和組成方面的信息[7-8]，使得對于土壤微生物多樣性的研究仍然匱乏，有關其演替規(guī)律及與環(huán)境因子的關系仍不明了[9]。

真菌是土壤微生物的重要組成部分，是土壤肥力和健康的重要指標之一，直接影響土壤物質循環(huán)、養(yǎng)分轉化和作物病害發(fā)生等[10-14]。研究表明，真菌不僅能分解土壤中有機質為植物提供養(yǎng)分，而且還可以改善土壤結構并提高作物產(chǎn)量[11-13]。目前基于傳統(tǒng)微生物學研究方法的研究顯示，秸稈還田能夠提高土壤真菌的Shannon-Weiner 多樣性指數(shù)，促進微生物量的生長和土壤呼吸，并且改變微生物群落結構[15-18]，然而由于土壤中大部分真菌很難分離培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法難以有效揭示其功能與作用，近年來興起的現(xiàn)代分子生物學技術如高通量測序技術等，為深入探究土壤真菌群落組成、功能及其適應機制提供了良好的契機[19-21]，有助于闡述秸稈還田后真菌群落的響應規(guī)律。

本文擬利用Illumina測序技術，研究不同量小麥秸稈施用于兩種類型稻田土壤后真菌群落的組成和多樣性，旨在揭示稻田土壤真菌群落對秸稈還田的響應規(guī)律，并結合土壤性質進一步揭示土壤真菌群落遷移的驅動因子。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過文獻檢索和實地調研，選擇了兩種長期稻麥輪作田塊作為典型土壤采樣點，分別來自江蘇省泰州市的高砂土(GS)和無錫市的黃泥土(HN)。采集土壤風干過2 mm篩，混合均勻后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

供試秸稈是成熟收割后的小麥秸稈，來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院小麥試驗基地。小麥秸稈曬干后磨碎，過10目篩，貯存于4 ℃ 備用。

1.2 試驗設計

試驗設置4種處理，分別為不添加小麥秸稈即對照(CK)、施用10 g/kg小麥秸稈(WS10)、施用20 g/kg小麥秸稈(WS20)、施用50 g/kg小麥秸稈(WS50)。

稱取400 g 土壤(干重)于廣口瓶中(直徑 10 cm ×高 15 cm)，分別設置以上4種處理，其中小麥秸稈與土壤混合均勻，添加去離子水使其處于淹水狀態(tài)，每個處理3次重復。將培養(yǎng)瓶置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)；在整個淹水培養(yǎng)期間，上覆水深度始終保持一致。培養(yǎng)30 d后，收集土壤孔隙水，用于溶解性有機碳(DOC)的測定；破壞性采樣收集土壤樣品，將土壤混合均勻，部分土壤風干后用于土壤pH、電導率、有機質、總碳和總氮的測定，部分鮮樣保存于-20 ℃ 冰箱用于真菌群落結構分析。

1.3 分析方法

1.3.1 化學性質的測定 pH采用酸度計(pHs-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠)測定(土∶水 = 1∶5)；電導率(EC)采用電導儀(DDSJ-318型電導率儀，上海雷磁儀器廠)測定；有機質(SOM)含量采用灼燒矢量法((550±5)℃, 6 h)測定；總碳(TC)與總氮(TN)含量采用元素分析儀(Vario MAX CNS, Elementar,Germany)測定，并計算碳氮比值(C/N)；溶解性有機碳(DOC)含量采用有機碳分析儀(Shimadzu TOC-Vcph, Japan)測定。

1.3.2 土壤 DNA 提取及其真菌群落分析 根據(jù)FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒說明書提取土壤中DNA，儲存于 -20 ℃ 備用。真菌PCR擴增采用具有 barcode的 18S rRNA 通用引物，ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。20 μl的擴增反應體系包括：10 ng模板 DNA、4 μl FastPfu Buffer(5×)、2 μl BSA(2.5 mmol/L)、0.8 μl ITS1F(5 μmol/L)、0.8 μl ITS2R(5 μmol/L)、18 μl滅菌水。每個樣品包括 3 個重復體系。擴增條件如下：94 ℃預變性3 min；30個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后在72 ℃ 再延伸5 min?；旌贤粯悠返?個PCR 產(chǎn)物重復樣，切膠回收并純化。將PCR產(chǎn)物用藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。所獲得的DNA送到上海凌恩生物有限公司，用于Illumina Miseq測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0對不同處理下土壤性質進行方差分析；利用QIIME(1.7.0)軟件計算真菌群落alpha多樣性和beta多樣性，其中真菌群落OTU種類用于表征 alpha多樣性，在QIIME平臺，根據(jù)樣品兩兩間unweight UniFrac distance進行主成分分析(PCA)用于表征樣品間真菌群落的相似性，即 beta多樣性；利用R(vegan數(shù)據(jù)包)分析不同群落之間差異的顯著性；利用R平臺 vegan數(shù)據(jù)包作典范相關對應分析(canonical correlation analysis, CCA)，鑒定影響真菌群落結構的主要影響因素。數(shù)據(jù)分析采用Excel進行，圖形繪制采用SigmaPlot 10.0。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

兩種類型稻田土壤理化性質見表1。由表1可以看出，不同類型土壤理化性質存在較大差異。高砂土屬砂質土，其土壤酸堿度(pH)、電導率(EC)、總碳(TC)和碳氮比(C/N)顯著高于屬于壤土的黃泥土，而黃泥土總氮(TN)和有機質(SOM)含量則顯著高于高砂土。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic properties of two tested paddy soils

不同量小麥秸稈(0、10、20 和50 g/kg)施用下，兩種類型土壤理化性質的變化見表2。由表2可以看出，與未施用秸稈的土壤相比，隨著秸稈還田量的增大，土壤pH逐漸降低，其中高砂土和黃泥土pH降低量分別由 4.37% 和 0.89% 逐漸增大到 6.14% 和5.47%。以上結果表明，秸稈還田顯著降低了土壤酸堿度，并隨著秸稈還田量的增加，土壤pH降低效應愈加顯著。

與pH不同，秸稈還田后高砂土EC、SOM、TC、TN、C/N和DOC含量分別增加了77.3%～227%、94.1%～525%、28.2%～143.7%、9.09%～63.6%、10.8%～50.3% 和 235%～1357%(P＜0.05)；而秸稈還田后黃泥土EC、SOM、TC、TN、C/N和DOC含量分別增加了 219%～1780%、11.7%～89%、57.1% ～197%、6.74%～34.8%、48.0%～125% 和 42.4% ～930%(P＜0.05)，并且當秸稈還田量為50 g/kg時，上述土壤指標增加量最大。以上結果表明，秸稈還田顯著提高了土壤電導率、有機質、總碳、總氮、碳氮比以及溶解性有機碳含量，并且隨著秸稈還田量的增加其含量也逐漸增大。

表2 淹水培養(yǎng)30 d后，不同量秸稈施用下土壤基本理化性質Table 2 Basic properties of soils under different straw return treatments after 30 days of flooding incubation

2.2 土壤真菌群落多樣性

利用Illumina高通量測序技術，24個不同量秸稈施用的土壤樣品按照 97% 相似性對非重復序列(不含單序列)進行 OTU聚類。圖 1為當測序深度30 000時稻田土壤真菌群落OTUs數(shù)，即稀疏曲線。由圖1可以看出，隨著秸稈還田量的增加，高砂土真菌群落多樣性逐漸降低，而黃泥土真菌群落多樣性雖然有所降低但并無顯著性變化。研究結果表明秸稈還田顯著降低了高砂土真菌群落多樣性(P＜ 0.05)；但對黃泥土真菌群落多樣性并無顯著性影響(P＞0.05)。

圖1 不同量秸稈施用下兩種類型稻田土壤真菌群落多樣性(平均值±標準差，n = 3)Fig. 1 Fungal community diversities in soils under different straw return treatments

2.3 土壤真菌群落組成

利用 Illumina高通量測序技術，24個不同量秸稈施用的土壤樣品的真菌群落組成分布見圖2。由圖2可以看出，未施用秸稈的高砂土在綱水平上的優(yōu)勢菌是散囊菌綱(Eurotiomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)，其相對豐度分別為34.3% 和33.3%；而未施用秸稈的黃泥土中糞殼菌綱為優(yōu)勢菌，相對豐度達80.4%。秸稈施用后高砂土中散囊菌綱的相對豐度顯著降低，而糞殼菌綱的相對豐度顯著提高(P＜ 0.05)；對于黃泥土，秸稈施用對土壤優(yōu)勢菌散囊菌綱的相對豐度并無顯著性影響，但當秸稈施用量為50 g/kg時，與未施用秸稈的黃泥土相比，黃泥土中糞殼菌綱的相對豐度顯著降低(P＜ 0.05)。以上結果表明，不同類型稻田土壤中真菌群落的優(yōu)勢菌組成存在差異，而土壤真菌群落的優(yōu)勢菌對秸稈還田的響應也與土壤類型密切相關。

為了進一步探究秸稈還田對土壤中真菌群落組成的影響，對不同量秸稈還田下土壤中真菌群落組成進行了主成分分析(PCA)(圖3)。由圖3可以看出，不同量秸稈還田下，高砂土真菌群落組成明顯不同，進一步的顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，與未施用秸稈相比，秸稈施用顯著改變了高砂土真菌群落結構，但不同量(10、20和50 g/kg)秸稈還田下，高砂土真菌群落組成并無顯著性差異。與未施用秸稈相比，秸稈施用量為10和20 g/kg時并未改變黃泥土真菌群落結構，而當秸稈施用量為50 g/kg時黃泥土中真菌群落結構有著顯著性遷移。以上研究結果表明，兩種類型土壤真菌群落結構對不同量秸稈還田的響應顯著不同。

圖2 不同量小麥秸稈施用下兩種類型稻田土壤真菌群落組成Fig. 2 Compositions of fungal communities in soils under different straw return treatments

圖 3 不同量秸稈施用下兩種類型稻田土壤(A. 高砂土；B. 黃泥土)真菌群落組成的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) of compositions of fungal communities in soils under different straw return treatments

2.4 土壤性質對真菌群落結構的影響

為了進一步探究土壤中真菌群落遷移的主要驅動因子，本論文基于典范相關分析(CCA)對環(huán)境因子和土壤真菌群落結構的關系進行探討，其中真菌屬和環(huán)境因子之間夾角的余弦值代表了二者之間的相關性。由圖4可以看出，在所用的環(huán)境因子(pH、EC、SOM、TC、TN、C/N、DOC)中，土壤 pH、EC 和SOM是影響秸稈還田后高砂土真菌群落遷移的重要因子，而pH、EC、SOM和C/N是影響秸稈還田后黃泥土真菌群落遷移的重要調控因子。其中，秸稈還田后土壤真菌群落的遷移與土壤pH呈明顯的負相關性，而與SOM、EC和C/N呈現(xiàn)明顯的正相關性。以上研究結果表明，秸稈還田主要是通過改變土壤性質來調控真菌群落組成。

圖4 不同量秸稈施用下兩種類型稻田土壤(A. 高砂土；B. 黃泥土)真菌群落組成的典范相關分析Fig. 4 Canonical correlation analysis (CCA) of compositions of fungal communities in soils under different straw return treatments

3 討論

真菌作為微生物的重要組成，推動著土壤有機質循環(huán)、養(yǎng)分轉化、毒物降解和作物病害發(fā)生等，而真菌群落多樣性是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)正常功能的前提條件[10-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，秸稈施用后兩種類型土壤真菌群落多樣性都一定程度地降低，這很可能主要是由于秸稈還田過程中能夠促進有機質的礦化，從而消耗土壤中大量氧氣，使土壤中微生物由好氧微生物逐漸以兼性厭氧微生物或厭氧微生物為主，而黃泥土屬壤土，由于其通氣性較差，淹水培養(yǎng)30 d后土壤中真菌很可能已經(jīng)以兼性厭氧微生物或厭氧微生物為主，因此秸稈施用后黃泥土真菌群落多樣性并未顯著降低，而很可能只是改變了土壤中兼性厭氧微生物或厭氧微生物的豐度?？傊瑸榱司S持土壤真菌群落多樣性，秸稈還田過程中可以采取一定措施(如干濕交替等)來適當增加土壤含氧量，盡可能避免土壤微生物多樣性的降低。

大量研究顯示土壤真菌群落結構受到許多環(huán)境因素的影響，其中土壤性質是調控土壤微生物群落結構的重要因子[22]。已有研究表明pH是引起微生物群落遷移的重要調控因子[23]，我們研究發(fā)現(xiàn)秸稈施用顯著降低了土壤酸堿度，這很可能是由于秸稈還田過程中會腐爛分解產(chǎn)生一些有機酸[24]，進一步的 CCA分析發(fā)現(xiàn)pH顯著改變了高砂土和黃泥土真菌群落組成。同時，由于秸稈中含有豐富的碳、氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，秸稈還田可以將作物中的營養(yǎng)元素歸還土壤，在一定程度上增加了土壤中碳氮等養(yǎng)分含量以及土壤電導率[25-27]。本研究中秸稈還田顯著提高了土壤EC約0.78～17.8倍，從而有利于土壤微生物間電子傳遞，進而改變真菌群落結構。另外，碳素供應是決定土壤微生物生長的關鍵性因素，其中有機質(SOM)作為微生物的重要碳源，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是土壤真菌群落改變的重要因子[28]。

本研究中兩種類型土壤真菌群落組成對不同量秸稈還田響應的差異很可能是由于不同類型土壤中微生物可利用的基質含量和種類各不相同所導致的。其中土壤 C/N已經(jīng)被報道是影響微生物群落的重要因子[29]，本研究中 C/N顯著改變了黃泥土真菌群落組成而對高砂土群落組成的遷移并無顯著性影響。這很可能是由于黃泥土自身 C/N較低不足以支持淹水期間土壤微生物的生長，而秸稈還田顯著提高了土壤C/N，從而為微生物生長提供了基質，并且隨著秸稈施用量的增大，土壤 C/N亦逐漸增大，因此與低秸稈施用量10 g/kg和20 g/kg相比，秸稈施用量為50 g/kg時顯著改變了黃泥土微生物群落組成；然而對于高砂土，自身 C/N較高足以支持微生物的生長，因此不同量秸稈施用下高砂土真菌群落組成并無顯著性差異。

4 結論

1)秸稈還田顯著降低了高砂土真菌群落多樣性，而對黃泥土真菌群落多樣性并無顯著影響。

2)秸稈還田顯著改變了高砂土真菌群落組成，但不同秸稈還田量下，土壤真菌群落組成并無顯著性差異；對于黃泥土，與未施用秸稈的土壤相比，秸稈施用量為10和20 g/kg時，黃泥土真菌群落組成并無顯著改變，而當秸稈施用量為50 g/kg時黃泥土真菌群落組成有著明顯遷移。

3)pH、SOM、EC是影響秸稈還田后高砂土真菌群落遷移的重要因子；與高砂土不同，pH、SOM、EC和C/N是影響秸稈還田后黃泥土真菌群落遷移的重要調控因子。

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