何貴山，王 燕，王賽元

(甘肅天然源生物科技有限公司，蘭州 730050)

作為日常最佳保健食品之一，大蒜的營養(yǎng)和藥用價值已被人們廣泛認(rèn)可，大蒜中不僅含有較高的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類，而且富含鈣、鐵、磷、硒、鍺等礦物元素和多種維生素[1-2]。大蒜中氨基酸含量占粗蛋白含量的16%以上，尤其以精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸等最為豐富，其中精氨酸含量占氨基酸總量的20.4%[3-4]。

大蒜用途廣泛，除鮮食外，還被經(jīng)常加工成蒜汁飲料、蒜泥、蒜粉、脫水蒜片等制品。我國作為大蒜的主要生產(chǎn)國，大蒜已經(jīng)成為河南、山東、河北等地部分區(qū)域農(nóng)民增收的重要來源之一[5-7]。由于大蒜存在一定的休眠期，而且溫度越低大蒜的休眠期越短，休眠期過后大蒜體內(nèi)的綠色素前體物會逐漸增多，如果直接吃外觀上可能沒什么區(qū)別，但在工業(yè)化生產(chǎn)中一旦榨汁、搗泥，導(dǎo)致細(xì)胞破碎，大蒜體內(nèi)積累的綠色素前體物和蒜氨酸酶一接觸，使得大蒜汁迅速變綠[8-9]。綠變問題嚴(yán)重影響了大蒜的再加工和大蒜產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展?，F(xiàn)階段已有眾多學(xué)者對大蒜綠變反應(yīng)的控制、綠色素的性質(zhì)和合成途徑做了大量研究。

1 吡咯基氨基酸對大蒜綠變的影響

Imai S等[10]為了證明吡咯基氨基酸對大蒜綠變有影響，在體外進行了模擬色素形成的實驗研究，研究發(fā)現(xiàn)，用丙氨酸或纈氨酸與丙烯基硫代亞磺酸酯反應(yīng)會生成吡咯基氨基酸，將吡咯基氨基酸再與烯丙基硫代亞磺酸酯反應(yīng)生成藍色色素。Wang D等[10]也做了體外合成吡咯基氨基酸的模型研究，所有模型實驗合成的外源化合物吡咯基氨基酸加入蒜泥或著蒜汁中都可以使其發(fā)生不同程度的綠變，這些研究結(jié)果都證明吡咯基氨基酸及其化合物是大蒜綠色素形成的前體物，對大蒜綠變存在著重要影響[11]。

現(xiàn)階段關(guān)于大蒜綠變機理的研究，學(xué)者們大都采用體外化學(xué)模擬的方法，通過大量的實驗證實大蒜綠色素形成是吡咯環(huán)進一步聚合的結(jié)果，推測出吡咯基氨基酸是大蒜綠色素的前體物質(zhì)，比如纈氨酸-吡咯[12-13]。研究者們發(fā)現(xiàn)，氨基酸的種類不同，其聚合后形成的色素也不一樣，并且有的氨基酸聚合后不會形成色素，只有氨基和羰基游離的氨基酸才可以形成色素。在綠色素形成的過程中，氨基酸也是必須的，研究表明，大蒜綠色素的結(jié)構(gòu)中含有一個吡咯環(huán)，但是單獨的吡咯和氨基酸都不能使大蒜綠變，同時，吡咯基氨基酸作為色素前體物并不是絕對的，如吡咯基亮氨酸不能使蒜泥變綠，進而可知，大蒜綠色素對形成色素的前體物質(zhì)結(jié)構(gòu)上有著嚴(yán)格的要求[13-14]。

本文從大蒜綠變的反應(yīng)過程入手，探討了各種酶、S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜(PeCSO)、葉綠素前體物δ-氨基酮戊酸(δ-ALA)和膽色素原(PBG)的積累以及三羧酸循環(huán)對大蒜綠色素前體物—吡咯基氨基酸形成的影響，來控制蒜制品在加工中出現(xiàn)的綠變，為今后的有關(guān)研究提供理論參考與技術(shù)支撐，也對促進大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

2 大蒜綠變的反應(yīng)過程

在大蒜綠變反應(yīng)過程中，S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜(PeCSO)和S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜(ACSO)兩種風(fēng)味前體物質(zhì)在蒜氨酸酶的作用下，分解為2-丙烯基次磺酸和2-烯丙基次磺酸，兩種物質(zhì)分別發(fā)生聚合反應(yīng)，生成二丙烯基硫代亞磺酸酯和二烯丙基硫代亞磺酸酯(大蒜素)。其中，二丙烯基硫代亞磺酸酯與氨基和羰基游離的氨基酸反應(yīng)生成吡咯基氨基酸。吡咯基氨基酸與大蒜素反應(yīng)生成藍色物質(zhì)，但是由于藍色物質(zhì)不穩(wěn)定，會緩慢分解為黃色物質(zhì)，黃色物質(zhì)和未分解的藍色物質(zhì)混合在一起，形成所看到的綠色物質(zhì)，所以要從源頭上抑制大蒜變綠，阻止或隔斷吡咯基氨基酸的生成是一種行之有效的方法。

3 影響吡咯基氨基酸合成的因素

3.1 酶對吡咯基氨基酸的影響

3.1.1蒜氨酸酶 蒜氨酸酶存在于大多數(shù)的蔥屬植物中，是一種內(nèi)源酶，其在大蒜中的含量約占水溶性蛋白的12%。蒜氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，最適pH值為5～8，并且對底物有特異性要求[4，18]。從圖1可以看出，在蒜氨酸酶的催化作用下，PeCSO先分解為2-丙烯基次磺酸，2-丙烯基次磺酸發(fā)生聚合反應(yīng)，生成二丙烯基硫代亞磺酸酯。二丙烯基硫代亞磺酸酯和特定的氨基酸反應(yīng)，生成色素前體物，即醚不溶性的吡咯基氨基酸。大蒜中自身存在的許多物質(zhì)如半胱氨酸、氨基氧乙酸、氨基氧丙酸、鹽酸羥胺、環(huán)絲氨酸等都可以起到抑制蒜氨酸酶活性的作用，進而抑制烯丙基硫代亞磺酸酯以及吡咯基氨基酸的生成，其中鹽酸羥胺對酶產(chǎn)生的抑制作用為可逆的[4]。

3.1.2γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在生物體內(nèi)廣泛分布存在。它由大小兩個亞基構(gòu)成，活性中心位于小亞基上[19]。該酶的最適溫度比蒜氨酸酶的最適溫度要高，為42℃，最適pH值為8.5[4，20]。儲藏溫度對該酶的基因表達影響較大，低溫條件下，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因表達較強，合成速率也較快，當(dāng)儲藏溫度大于20℃時，該酶的基因表達會受到明顯的抑制。另外，大蒜具有一定的休眠期，通過測定不同休眠期大蒜中該酶的活性發(fā)現(xiàn)，在已打破休眠的大蒜中，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的活性很高，而剛收獲完不久正處于休眠期的大蒜中此酶的活性相對較低[20-21]。

由圖1可以看出，在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的催化作用下，大蒜中的某種γ-谷氨肽發(fā)生水解，促使后續(xù)反應(yīng)得以進行。盡管該酶沒有直接參與到綠色素前體物的生成過程，但卻是生成吡咯基氨基酸所需成分必不可少的環(huán)節(jié)。因此可以推測，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與吡咯基氨基酸的生成有著密切的關(guān)系。

圖1 大蒜綠變的反應(yīng)過程[15-17]

3.1.3催淚因子合成酶 來源于洋蔥的催淚因子合成酶，對大蒜綠色素的前體物也有一定的影響。如圖1所示，在大蒜綠變過程中，PeCSO在蒜氨酸酶的催化作用下先分解為2-丙烯基次磺酸，2-丙烯基次磺酸隨即發(fā)生聚合反應(yīng)，生成二丙烯基硫代亞磺酸脂，而此物質(zhì)是生成吡咯基氨基酸的重要物質(zhì)。Cho.J等[22-23]在試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向上述反應(yīng)體系中加入催淚因子合成酶時，由蒜氨酸酶催化生成的2-丙烯基次磺酸在該酶的催化作用下迅速分解為丙硫醛-S-氧化物，此物質(zhì)與氨基酸反應(yīng)生成的物質(zhì)不形成色素，只有一小部分2-丙烯基次磺酸聚合形成酯類，但由于量小，與氨基酸反應(yīng)也合成不了綠變前體物吡咯基氨基酸，故而不能產(chǎn)生綠變。

3.2 PeCSO對吡咯基氨基酸的影響

大蒜中S-烴基-L-半胱氨酸亞砜有四大類，含量最多的是ACSO，占到這四種成分總量的85%。其次是PeCSO，還有少量的S-甲基-L-半胱氨酸亞砜(MCSO)和S-丙基-L-半胱氨酸亞砜(PCSO)[17，24]。PeCSO容易受儲藏溫度的影響，當(dāng)大蒜在低溫下儲藏時，隨著時間的延長，PeCSO的含量也在逐漸增多。在大蒜未破碎以前，蒜氨酸酶和上述亞砜類化合物分別存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞的液泡中，當(dāng)大蒜破碎、受損或者大蒜榨汁時，蒜氨酸酶就會釋放出來和這些底物反應(yīng)[4，25]。S-烴基-L-半胱氨酸亞砜在蒜氨酸酶的作用下，產(chǎn)生丙酮酸、氨以及次磺酸，次磺酸不穩(wěn)定，通過聚合反應(yīng)，縮合成硫代亞磺酸酯，硫代亞磺酸酯與氨基酸反應(yīng)，形成色素的前體物—吡咯基氨基酸。

3.3 三羧酸循環(huán)對吡咯基氨基酸的影響

三羧酸循環(huán)是植物呼吸代謝重要途徑之一，許多生物可以利用三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物進一步反應(yīng)生成吡咯類化合物[26]。在新鮮的大蒜中檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量較低。在發(fā)生綠變的大蒜中檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量均有所增加，促進了α-酮戊二酸經(jīng)琥珀酰輔酶A形成吡咯類化合物的代謝途徑(圖2)。吡咯基化合物為大蒜綠色素提供吡咯結(jié)構(gòu)，所以大蒜綠色素前體物的形成會受到三羧酸循環(huán)的影響[27]。

圖2 三羧酸循環(huán)影響

3.4 合成葉綠素原料的積累對吡咯基氨基酸的影響

和紅云等[28]對植物在低溫儲藏條件下葉綠素的含量變化進行了探討，發(fā)現(xiàn)植物在低溫下儲藏，其葉綠素的含量明顯低于高溫下儲藏的含量，且隨著儲藏溫度的降低，該下降趨勢愈加明顯。但在低溫條件下葉綠素的前體物δ-氨基酮戊酸(δ-ALA)和膽色素原(PBG)的積累量卻明顯比高溫下儲藏要高，這表明植物在低溫儲藏時，葉綠素的生物合成途徑被阻斷，從而使葉綠素的前體物δ-ALA和PBG的消耗減少，造成積累[29]。而PBG是四吡咯化合物的母體，可以使生物體顯示一定的顏色，也是多種天然的四吡咯類色素合成的前體物質(zhì)。而氨基酮戊酸(ALA)是經(jīng)三羧酸循環(huán)的中間物琥珀酰CoA所引發(fā)的旁路系統(tǒng)中形成的，ALA在氨基酮戊酸脫水酶的作用下形成PBG[26]。低溫貯藏時，大蒜中積累的ALA和PBG很有可能是作為中間物質(zhì)參與了大蒜綠變色素前體物合成過程。

研究證實，葉綠素不是大蒜綠色素，因為大蒜綠色素的紫外吸收峰值與葉綠素的吸收峰值不一樣[31]，但生物合成途徑和葉綠素的生物合成途徑存在相似之處。

4 結(jié)語

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，大蒜的綠變是一個多步反應(yīng)，其中包括酶促反應(yīng)與非酶促反應(yīng)。本文從大蒜綠變的反應(yīng)過程著手，討論了各種酶、PeCSO、三羧酸循環(huán)和合成葉綠素原料的積累對大蒜綠色素前體物的影響。幾種影響因素中除了催淚因子合成酶是外源加入外，其余均為大蒜體內(nèi)本身存在或在反應(yīng)過程中生成的，且?guī)追N因素都受到溫度的影響，故可以根據(jù)每步反應(yīng)的特點與要素以及相關(guān)的影響因素來尋找在大蒜加工過程中控制大蒜綠變前體物——吡咯基氨基酸的具體措施，進而控制大蒜綠變。◇

[1]郝曉然，牟聰華，等.大蒜綠變過程中幾種關(guān)鍵物質(zhì)的變化規(guī)律[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5)：81-85.

[2]王巖.大蒜綠色素提取、分離及其性質(zhì)的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[3]康雅.大蒜的營養(yǎng)成分及其保健功能[J].中國食物與營養(yǎng)，2010(9)：75-77.

[4]趙飛.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶-蒜氨酸酶與大蒜綠變的關(guān)系[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[5]于善亮.中牟縣大蒜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[6]丁超.對我國大蒜產(chǎn)銷的調(diào)查與思考[J].長江農(nóng)業(yè)，2007(10)：1-3.

[7]井鳳燕，王書強.大蒜成了武城農(nóng)民增收致富的“拳頭產(chǎn)品”[J].中國品牌與防偽，2006(8)：83.

[8]馮素萍.入庫時間和儲藏溫度對大蒜冷藏效果的影響[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[9]徐為民，劉郵洲，等.大蒜泥加工中發(fā)綠現(xiàn)象的控制研究[J].食品工業(yè)科技，2003，24(1)：71-72.

[10]Wang D，Nanding H，Han N，et al.2-(1Hpyrrolyl)carboxylic acids as pigment precursors in garlic greening[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008(56)：1495-1500.

[11]郝曉然.大蒜綠變過程中幾種關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12]江英，胡曉松，廖曉軍，等.蒜泥綠變機理的研究[J].中國食品學(xué)報，2003，3(1)：41-47.

[13]楠丁呼思勒，王丹，等.吡咯基氨基酸化合物在大蒜綠變中的作用研究[J].食品工業(yè)科技，2008，28(11)：121-122.

[14]Kazaryan RA；Goryachen kova EV.Aliiinase：Purification and physicochemical properties，Chem Abstr[J].1981(95)：58069.

[15]王巖，喬旭光.大蒜綠變機理的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng)，2005(11)：23-25.

[16]李蕾.大蒜綠變機理初探[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[17]張琦梅，繆冶煉，等.大蒜綠變反應(yīng)及其抑制技術(shù)研究進展[J].食品科技，2013，38(9)：234-243.

[18]王靜.蒜氨酸酶性質(zhì)及無臭脫水蒜片生產(chǎn)工藝研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[19]Cornwell PD，Watkins JB.Changes in the kinetic parameters of hepatic γ-glutamyltransferase from streptozotocin-induced diabetic rats[J].Biochimica et Biophysica Acta，2001，1545(1-2)：184-191.

[20]江英，胡小松，廖小軍，等.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與蒜泥綠變的關(guān)系[J].食品科學(xué)，2002(a)，23(5)：38-40.

[21]趙飛，喬旭光.大蒜γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的分離純化和部分酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國食品學(xué)報，2009，9(1)：41-45.

[22]Cho J，Lee EJ，Yoo KS，et al.Role of precursors on greening in crushed garlic bulbs，and its control with freeze-dried onion powder[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92(2)：246-256.

[23]Lee EJ，Yoo KS，Patil BS.Freeze-dried fresh onion powder prevents green discolouration(greening)in macerated garlic[J].Food Chemistry，2012，131(2)：397-404.

[24]劉玉婷，吳宏偉，等.半胱氨酸在食品中的應(yīng)用研究[J].中國調(diào)味品，2009，34(12)：33-39.

[25]朱廣廉，鐘海文，張愛琴.植物生理學(xué)實驗[M].北京：北京大學(xué)出版社，1990.

[26]牟聰華.大蒜綠變色素生物合成途徑的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[27]盧曉明.5氨基酮戊酸脫水酶基因的克隆表達及與大蒜綠變關(guān)系的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[28]和紅云，薛琳，田麗萍，等.低溫脅迫對甜瓜幼苗葉綠素含量及熒光參數(shù)的影響[J].北方園藝，2008(4)：13-16.

[29]崔海瑞，夏英武，高明尉.溫度對水稻突變體W1葉色及葉綠素生物合成的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2001，15(5)：269-273.

[30]張云靜.膽色素原脫氨酶的性質(zhì)及其與大蒜綠變的關(guān)系[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.