劉 靜 陶欣榮 楊 輝 張榮波

安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)前沿實驗中心，安徽 淮南 232001

cAMP直接激活的交換蛋白(exchange protein directly activated by cAMP，Epac)也稱cAMP-鳥嘌呤交換因子(cAMP-GEF)。1998年，由DE ROOIJ等[1]首次發(fā)現(xiàn)。同年，Epac的兩種異構(gòu)體被發(fā)現(xiàn)，即Epac1(cAMP-GEF-Ⅰ)和Epac2(cAMP-GEF-Ⅱ)[2]。Epac作為cAMP的胞內(nèi)受體，可以單獨或與PKA聯(lián)合接受cAMP作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Epac參與多種疾病的病理生理過程，包括精神分裂癥、阿爾茲海默綜合征、自閉癥等。我們回顧了Epac與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性的研究進(jìn)展和動物實驗結(jié)果，以Epac為靶點研究新的藥物，可作為幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的治療方法。

1 Epac的分布

Epac有兩種亞型Epac1和Epac2。Epac1在體內(nèi)分布廣泛，主要在心臟、血管、腎、肺、脂肪組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮等組織中表達(dá)。Epac2A、Epac2B以及Epac2C是Epac2的3種剪切變異體，其中Epac2A主要分布在胰腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌組織，Epac2B則主要分布在腎上腺，而Epac2C主要在肝臟中表達(dá)。在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，Epac1分布在細(xì)胞核周，Epac2A主要在細(xì)胞質(zhì)中。PARNELL等[3]的實驗也證實了這一點，將Epac1-HA或Epac2A-HA轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，通過免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Epac1在核膜集聚，Epac2A則均勻分布在整個細(xì)胞。

2 Epac的結(jié)構(gòu)和功能

2．1 Epac的結(jié)構(gòu)Epac的異構(gòu)體Epac1和Epac2擁有相似的結(jié)構(gòu)特點，由C端的催化域和N端的調(diào)節(jié)域共同構(gòu)成的一種多結(jié)構(gòu)域的蛋白。C端的催化域攜帶CDC25域，通過REM及RA域穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)。REM域能夠?qū)DP轉(zhuǎn)化為GTP，RA域則可將CDC25域與REM域分離開。N端的調(diào)節(jié)域包括膜錨定蛋白DEP域和高親和力的cAMP-B域。DEM域主要作用在于調(diào)節(jié)Epac1重新分布到質(zhì)膜上，這一過程中cAMP-B域起輔助作用，進(jìn)一步提高了Epac1質(zhì)膜定位的準(zhǔn)確性。此外，通過對Epac2基因敲出的小鼠重新導(dǎo)入外源的Epac2發(fā)現(xiàn)，Epac2A主要存在于胰島細(xì)胞的質(zhì)膜附近，而Epac2B主要在細(xì)胞質(zhì)中，單獨將cAMP-A域?qū)爰?xì)胞后也定位在質(zhì)膜附近[4]，進(jìn)一步證明了N端 cAMP-A域在亞細(xì)胞定位的過程中也發(fā)揮了重要的作用。Epac1和Epac2兩者結(jié)構(gòu)的差異主要在于Epac2的N末端有環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cyclic nucleotide-binding domain，CNBD)[5]，CNBD1能夠降低環(huán)磷腺苷的親和力 。

2．2 Epac的功能Epac在體內(nèi)的廣泛分布導(dǎo)致其功能的多樣性。神經(jīng)系統(tǒng)中Epac可以增強突觸的傳遞，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[6]。Epac聯(lián)合PKA協(xié)同作用誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化[7]，cAMP/Epac信號通路加強腦內(nèi)出血的的炎癥反應(yīng)[8]。另外，Epac1能夠抑制肝星狀細(xì)胞的增殖[9-10]，從而進(jìn)一步抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的過程。Epac2A缺失引起的葡萄糖刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素受損[11]，GLP-1受體激動劑利拉魯肽和格列美脲合用會降低胰島素分泌，而Epac2A(+/+)小鼠的胰島素分泌增強[12]。激活的Epac1可以減弱離體培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，Epac1的選擇性激動劑能夠減輕血管炎癥反應(yīng)。此外，Epac參與了癌細(xì)胞的遷移[13]，敲除Epac能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[14]。除上述功能外，Epac還參與細(xì)胞內(nèi)的多種反應(yīng)，如鈣離子的觸發(fā)、胞吐、細(xì)胞連接的形成等。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞Epac1缺失可以導(dǎo)致SMAD7蛋白水平增加，減少SMAD4的表達(dá)同時能夠抑制SMAD2的磷酸化以應(yīng)對TGFβ1的治療[15]。

3 Epac與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)性

3．1 Epac與精神分裂癥精神分裂癥是一種多因素引起的破壞性精神類疾病，常表現(xiàn)為幻覺、精神錯亂、社交退化、情感扁平化等。cAMP級聯(lián)反應(yīng)可以調(diào)控一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程，cAMP主要通過刺激環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)、PKA以及Epac參與機體活動[16-17]。雖然對PKA做了很多研究，但目前對Epac在中樞系統(tǒng)的功能了解甚少，但有相關(guān)研究表明，cAMP的下游分子Epac可能與精神分裂癥有關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)整合素和Gas蛋白影響精神分裂癥的病理過程。

Epac/Rap1信號通路可以激活整合素信號傳遞誘導(dǎo)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，阻斷整合素信號傳遞與精神分裂癥密切相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在Ovcar3 細(xì)胞中加入Epac激動劑后，貼壁細(xì)胞的百分比上升明顯，細(xì)胞的黏附力增強[18]。整合素是細(xì)胞黏附分子，在大腦發(fā)育和維持大腦功能中扮演至關(guān)重要的角色。細(xì)胞黏附分子基因的點突變可能會改變配體的結(jié)合，從而增加精神分裂癥的易患性。日本科學(xué)家SUPRIYANTO等[19]選擇中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞黏附分子的15個基因位點檢測其與278例精神病患者和284名正常人的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)ITGA8基因(整合素基因)與精神分裂癥密切相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，缺乏整合素信號傳遞的小鼠將導(dǎo)致精神分裂癥的相關(guān)表型[20]。由此我們推斷，Epac/Rap1信號通路通過介導(dǎo)細(xì)胞黏附的過程，從而進(jìn)一步促進(jìn)或抑制精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展。

Epac能夠調(diào)控Gas蛋白。Gas是G蛋白的亞單位，Gas在體內(nèi)過表達(dá)將導(dǎo)致成人精神分裂癥的相關(guān)表型，表現(xiàn)為驚反射的前脈沖抑制實驗(prepulse inhibition of acoustic startle，PPI)異常。AVISSAR等[21]通過分析正常人與未經(jīng)治療的精神分裂癥患者的單核細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者的Gas信號通路明顯提高。以此為基礎(chǔ)，KELLY等[22]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立動物模型使Gas在小鼠體內(nèi)過表達(dá)，與對照組相比，Gas組小鼠PPI明顯偏低。通過檢測轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回、CA1區(qū)等腦區(qū)Gas mRNA的表達(dá)水平明顯提高，進(jìn)一步檢測后發(fā)現(xiàn)，在Gas過表達(dá)的小鼠海馬皮質(zhì)、海馬、前額皮質(zhì)cAMP水平顯著下降。cAMP水平的下降進(jìn)而引發(fā)對下游分子Epac的激活減少。治療精神病的藥物均可提高C57BL/6J的 PPI，通過使用Epac的激動劑8-pCPT-2’-O-Me-cAMP明顯提升了PPI，說明Epac在精神分裂癥是一個關(guān)鍵的靶點。

3．2 Epac與阿爾茲海默綜合征阿爾茲海默綜合征(Alzheimer's disease，AD)是臨床常見的一種與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病早期較為明顯的癥狀主要是記憶力減退并伴大腦神經(jīng)元的變性，進(jìn)而逐步發(fā)展為自理能力及認(rèn)知功能障礙，引起嚴(yán)重的癡呆，最終導(dǎo)致患者死亡。

Epac通過調(diào)控miR-124在AD過程中起重要作用。在AD患者前額皮質(zhì)中，Epac1上調(diào)，Epac2下調(diào)。在神經(jīng)炎癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Epac1蛋白的表達(dá)量上升。大量流行病學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)已表明，散發(fā)性AD是由慢性腦灌注不足導(dǎo)致的血管障礙。微小RNA(miRNA)是低氧應(yīng)激反應(yīng)的理想介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞對長期低氧的適應(yīng)。AD患者腦中miR-124表達(dá)下降[23]。Epac能夠抑制miR-124的轉(zhuǎn)錄，主要通過激活Ras樣小GTP酶Rap1或Rap2。將Epac(+/+)或Epac(-/-)神經(jīng)元(DIV16)分別用20 mmol/L 8-pCPT-Me-cAMP處理6 h后，Epac(+/+)組明顯減少了miR-124的轉(zhuǎn)錄(P<0.01)[24]。在慢性腦灌注不足的情況下，miR-124下調(diào)可通過Epac/Rap1通路的激活。ZHANG等[25]發(fā)現(xiàn)，在慢性腦灌注不足動物模型中，術(shù)后90 d后與假手術(shù)組相比，海馬內(nèi)Epac1和Epac2分別上升了1.5倍和4倍，Rap上升了30%。另外，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中加入Epac激動劑，6 h后檢測Rap1的活性上升了30%，而miR-124的表達(dá)下降到22%。也有研究發(fā)現(xiàn)，Epac可以通過控制miR-124影響小鼠的空間記憶和社會交往[24]。因此，阻斷Epac/Rap1信號通路，可能減緩AD的發(fā)病進(jìn)程，減慢記憶力損傷，緩解臨床癥狀。

近來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在東莨菪堿導(dǎo)致的癡呆模型中，通過Epac/miR-124/Egr1信號通路調(diào)控褪黑素合成，進(jìn)而減輕突觸紊亂[26]。AD患者血清中褪黑素水平下降，補充褪黑色素能夠逆轉(zhuǎn)AD的病理和記憶力缺陷。Epac/Rap1通路和Epac/miR-124/Egr1信號通路調(diào)節(jié)miR-124在AD發(fā)病過程中發(fā)揮作用，但其具體的機制仍不清楚。

3．3 Epac與自閉癥自閉癥多見于兒童，常見癥狀為社會交往、語言交流和重復(fù)行為的缺陷，是一種包括遺傳因素在內(nèi)的由多種不明原因引起的神經(jīng)發(fā)育障礙，近年來發(fā)病率穩(wěn)步增長[27]。也有報道發(fā)現(xiàn)，母親免疫力的激活也會增加兒童自閉癥的風(fēng)險和嚴(yán)重程度[28]。

異常的突觸功能及樹突結(jié)構(gòu)的減少導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)育障礙，是自閉癥病因的一個重要組成部分。Epac2罕見的編碼變異能夠引起自閉癥，DEEPAK等[29]通過對孕C57BL小鼠子宮內(nèi)的胚胎進(jìn)行電穿孔使2/3層處的皮質(zhì)神經(jīng)元的Epac2被敲出，損傷Epac2與Ras之間的相互作用，影響Ras-Epac2-Rap通路，從而減少了基底樹突的結(jié)構(gòu)，選擇性減少皮質(zhì)錐體基底樹突的復(fù)雜性。HUTSLER等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在自閉癥患者腦組織皮質(zhì)2/3層的皮質(zhì)神經(jīng)元頂端樹突的數(shù)量增加，揭示了頂端樹突的數(shù)量與認(rèn)知的功能成反比。這些發(fā)現(xiàn)提示，Epac2能夠調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元2/3層神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響自閉癥的發(fā)病進(jìn)程。

4 結(jié)語

神經(jīng)系統(tǒng)疾病一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的難點，給人們的正常生活帶來了重大壓力及經(jīng)濟損失。但關(guān)于Epac與神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)性研究近年來還較少，Epac作為cAMP下游重要分子，可能在精神分裂癥、阿爾茲海默綜合征、自閉癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病起著重要作用。Epac功能的多樣性增加了我們的研究興趣，但其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的具體發(fā)病機制還不十分清楚。對Epac的深入研究，尤其是Epac對神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的影響及機制研究，為解決神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的難點提供有效的治療靶點和途徑。

[1] DE ROOIJ J，ZWARTKRUIS F J，VERHEIJEN M H，et al．Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP[J]．Nature，1998，396(6 710)：474-477．

[2] KAWASAKI H，SPRINGETT G M，MOCHIZUKI N，et al．A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia[J]．Science，1998，282：2 275-2 279．

[3] PARNELL E，SMITH B O，YARWOOD S J，et al．The cAMP sensors，EPAC1 and EPAC2，display distinct subcellular distributions despite sharing a common nuclear pore localisation signal[J]．Cell Signal，2015，27(5)：989-996．

[4] NIIMURA M，MIKI T，SHIBASAKI T，et al．Critical role of the N-terminal cyclic AMP-binding domain of Epac2 in its subcellular localization and function[J]．Cell Physiol，2009，219(3)：652-658．

[5] DE ROOIJ J，REHMANN H，VAN TRIEST M，et al．Mechanism of regulation of the Epac family of cAMP-dependent RapGEFs[J]．Biol Chem，2000，275(27)：20 829-20 836．

[6] ALONSO B，BARTOLOME-MARTIN D，F(xiàn)ERRERO J J，et al．CB1 receptors down-regulate a cAMP/Epac2/PLC pathway to silence the nerve terminals of cerebellar granule cells[J]．Neurochem，2017，142(3)：350-364．

[7] MUNOZ-LLANCAO P，DE GREGORIO C，LAS HERAS M，et al．Microtubule-regulating proteins and cAMP-dependent signaling in neuroblastoma differentiation[J]．Cytoskeleton (Hoboken)，2017，74(3)：143-158．

[8] LUO X，ZHU Q，ZHANG J，et al．The Double Roles of the Prostaglandin E2 EP2 Receptor inIntracerebral Hemorrhage[J]．Curr Drug Targets，2017，18(12)：1 377-1 385．

[9] YANG Y，YANG F，WU X，et al．EPAC activation inhibits acetaldehyde-induced activation and proliferation of hepatic stellate cell via Rap1[J]．Can J Physiol Pharmacol，2016，94(5)：498-507．

[10] SCHIPPERS M，BELJAARS L，POST E，et al．Upregulation of Epac-1 in Hepatic Stellate Cells by Prostaglandin E2 in Liver Fibrosis Is Associated with Reduced Fibrogenesis[J]．Pharmacol Exp Ther，2017，363(2)：126-135．

[11] HWANG M，GO Y，PARK J H，et al．Epac2a-null mice exhibit obesity prone nature more susceptible to leptin resistance[J]．Int J Obes，2017，41(2)：279-288．

[12] TAKAHASHI H，SHIBASAKI T，PARK J H，et al．Role of Epac2A/Rap1 Signaling in Interplay Between Incretin and Sulfonylurea in Insulin Secretion[J]．Diabetes，2015，64(4)：1 262-1 272．

[13] KUMAR N，PRASAD P，JASH E，et al．Insights into exchange factor directly activated by cAMP (EPAC) as potential target for cancer treatment[J]．Mol Cell Biochem，2018，5：1-6．

[14] GAO M，MA Y，BAST R C，et al．Epac1 knockdown inhibits the proliferation of ovarian cancer cells by inactivating AKT/Cyclin D1/CDK4 pathway in vitro and in vivo[J]．Med Oncol，2016，33(7)：73．

[15] ALMAHARIQ M，MEI F C，WANG H，et al．Exch-ange protein directly activated by cAMP modulates regulatory T-cell-mediated immunosuppression[J]．Biochem J，2015，465(2)：295-303．

[16] INSEL P A，MURRAY F，YOKOYAMA U，et al．cAMP and Epac in the regulation of tissue fibrosis[J]．Br J Pharmacol，2012，166(2)：447-456．

[17] ROBERTS O L，DART C．cAMP signalling in the vasculature：the role of Epac (exchange protein directly activated by cAMP)[J]．Biochem Soc，2014，42(1)：89-97．

[18] RANGARAJAN S，ENSERINK J M，KUIPERIJ H B，et al．Cyclic AMP induces integrin-mediated cell adhe-sion through Epac and Rap1 upon stimulation of the beta2-adrenergic receptor[J]．Cell Biol，2003，160(4)：487-493．

[19] SUPRIYANTO I，WATANABE Y，MOURI K，et al．A missense mutation in the ITGA8 gene，a cell adhesion molecule gene，is associated with schizophr-enia in Japanese female patients[J]．Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2013，40：347-352．

[20] BOUVARD D，BRAKEBUSCH C，GUSTAFSSON E，et al．Functional consequences of integrin gene muta-tions in mice[J]．Circ Res，2001，89(3)：211-223．

[21] AVISSAR S，BARKI-HARRINGTON L，NECHAMKIN Y，et al．Elevated dopamine receptor-coupledG(s) protein measures in mononuclear leukocytes of patients with schizophrenia[J]．Schizophr Res，2001，47(1)：37-47．

[22] KELLY M P，STEIN J M，VECSEY C G，et al．Developmental etiology for neuroanatomical and cognitive deficits in mice overexpressing Gas，a G-protein subunit genetically linked to schizophrenia[J]．Mol Psychiatry，2009，14：398-415．

[23] SMITH P，AL HASHIMI A，GIRARD J，et al．In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs[J]．Neurochem，2011，116(2)：240-247．

[24] YANG Y，SHU X，SHANG Y，et al．EPAC null mutation impairs learning and social interactions via aberrant regulation of miR-124 and Zif268 translation[J]．Neuron，2012，73(4)：774-788．

[25] ZHANG X，HUANG X，F(xiàn)ANG C，et al．miR-124 Regulates the Expression of BACE1 in the Hippocampus Under Chronic Cerebral Hypoperfusion[J]．Mol Neurobiol，2017，54(4)：2 498-2 506．

[26] WANG X，WANG Z H，WU Y Y，et al．Melatonin attenuates scopolamine-induced memory/synaptic disorder by rescuing EPACs/miR-124/Egr1 pathway[J]．Mol Neurobiol，2013，47(1)：373-381．

[27] YE B S，LEUNG A O W，WONG M H，et al．The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children[J]．Environ Pollut，2017，227：234-242．

[28] PATEL S，MASI A，DALE R C，et al．Social impairments in autism spectrum disor-der are related to maternal immune history profile[J]．Mol Psychiatry，2017 Oct 10．[Epub ahead of print]

[29] SRIVASTAVA D P，WOOLFREY K M，JONES K A，et al．An Autism-Associated Variant of Epac2 Reveals a Role for Ras/Epac2 Signaling in Controlling Basal Dendrite Maintenance in Mice[J]．Plos Biology，2012，10(6)：e1001350．

[30] HUTSLER J J，ZHANG H．Increased dendritic spine densities on cortical projection neurons in autism spectrum disorders[J]．Brain Res，2010，1 309：83-94．