李宏洋,劉鐵梅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長春130033)

1953年，兩名嬰兒出生時(shí)血小板嚴(yán)重減少，而母親具有正常血小板計(jì)數(shù)。在Shulman的兩個(gè)案例中，母親特異性的針對于血小板同種異體抗原PlA1抗體的胎盤轉(zhuǎn)移是新生兒血小板破壞的原因。后來由一位荷蘭人發(fā)現(xiàn)PlA1與Zwa抗原是完全相同的，并且現(xiàn)在被稱為“HPA-1a”[1]。在隨后的幾年中，出現(xiàn)許多其他能夠誘導(dǎo)產(chǎn)婦在懷孕期間免疫并導(dǎo)致胎兒血小板破壞的血小板特異性抗原，據(jù)統(tǒng)計(jì)NAIT在高加索人中的發(fā)病率是千分之一。

1 發(fā)病機(jī)制

孕產(chǎn)婦的異源免疫主要來自于母親的血小板抗原和胎兒從父親那里繼承來的血小板抗原的不相容。這種免疫通常在分娩第一胎不相容的胎兒后持續(xù)存在或者短暫存在[2]。母體IgG免疫球蛋白穿越胎盤包住胎兒血小板，除去胎兒網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重血小板減少癥。

2 NAIT相關(guān)抗原

血小板膜糖蛋白以雙等位基因形式存在，其中一些具有免疫原性。在血小板特異性抗原的每個(gè)系統(tǒng)中，高頻和低頻的等位基因分別稱為“a”和“b”。能夠引發(fā)NAIT的抗原位于血小板上的膜糖蛋白(GPs)GPIb-V-IX(血管性血友病因子受體)，GPIIb / IIIa(αIIb/β3整聯(lián)蛋白，纖維蛋白原受體)GPIa / IIa(膠原受體)和CD109，糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的不確定功能的蛋白質(zhì)?？傊?，這些血小板GP與細(xì)胞外基質(zhì)和凝血因子的蛋白質(zhì)相互作用以促進(jìn)止血[3]。遺傳的多態(tài)性就是由于位于六種不同的糖蛋白(GPIIb，GPIIIa，GPIbα，GPIbβ，GPIa，CD109)上的至少27個(gè)單個(gè)氨基酸取代導(dǎo)致的，并且已證明是他們引起母體在懷孕期間免疫，導(dǎo)致NAIT[4]。

2.1 HPA抗原系統(tǒng)

NAIT涉及的第一種人血小板抗原是HPA-1a(最初稱為P1A1)，來自PSI(凝集素-信號素-整聯(lián)蛋白)位置33處同源結(jié)構(gòu)域GPIIb / IIIa復(fù)合物的GPIIIa亞基(αIIb /β3整聯(lián)蛋白)的亮氨酸/脯氨酸置換。母胎HPA-1a不相容是迄今為止在白種人和非洲血統(tǒng)家族中最常見的NAIT的原因，在鑒定了HPA特異性抗體的病例中約占85%[5]。超過90%的HPA-1a抗體是由于婦女DRB3*0101(DR52a)抗原陽性所致。這種相關(guān)性似乎與含有Leu33的GPIIIa肽與DRB3*0101的肽結(jié)合槽的高親和力相關(guān)[6]。另外，HPA-1，-2，-3，-5和-15，也同樣可以引起NAIT。

2.2 ABO抗原

已知血小板通常在其表面表達(dá)少量的A和B抗原。Curtis等人[7]證實(shí)在一些個(gè)體中，血小板A1和B抗原水平極高，范圍高達(dá)每個(gè)血小板20000個(gè)抗原位點(diǎn)。因此如果與其母親ABO不相容，則可能處于血小板減少癥的風(fēng)險(xiǎn)中。

2.3 糖蛋白IV CD36

糖蛋白IV(CD36)是B類清道夫受體家族成員，在血小板，紅細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和其他組織上表達(dá)的蛋白質(zhì)。約5%的非洲或亞洲血統(tǒng)的人，突變導(dǎo)致CD36表達(dá)失敗，如果通過輸血或懷孕暴露于蛋白質(zhì)則具有免疫的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上母親針對于CD36免疫相關(guān)的NAIT的圖片與受HPA特異性抗體影響的嬰兒相似[8]。

2.4 HLA抗原

人血小板攜帶至少20000個(gè)I類HLA抗原拷貝，占循環(huán)血液中大多數(shù)HLA抗原，鑒于約三分之一的經(jīng)產(chǎn)婦對I類HLA敏感，在一些新生兒中可能存在I類HLA抗體引起NAIT。只有10%的HPA-1b1b母親對于胎兒HPA-1a將產(chǎn)生HPA-1a抗體。如果母親具有DRB3 * 0101等位基因，則免疫的風(fēng)險(xiǎn)增加。30%的人口存在這種情況，而且它是HPA-1a多肽存在時(shí)產(chǎn)生同種抗體至關(guān)重要的[9]。缺少DRB3 * 0101幾乎排除了同種異體免疫。

3 臨床表現(xiàn)

NAIT的臨床表現(xiàn)情況不一，出血征象包括：無出血，瘀點(diǎn)，血腫，胃腸道出血，血液滲出，血尿，視網(wǎng)膜出血和ICH。在前瞻性研究中，可以看到NAIT病例中較大比例是無癥狀的。而NAIT最嚴(yán)重的并發(fā)癥就是ICH。ICH發(fā)生在15%的HPA-1a NAIT新生兒中并伴隨著嚴(yán)重血小板減少(<50×109/L)，死亡率為15%[10]。因此孕婦產(chǎn)前HPA抗體篩查勢在必行。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 血清學(xué)方法

免疫分析方法是抗體鑒定的主要工具，但并不是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。使用血小板作為靶細(xì)胞檢測HPA抗體的方法，如單克隆抗體特異性固定化血小板抗原(MAIPA)試驗(yàn)，血小板抗原捕獲(PAC)試驗(yàn)，間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)(MPHA)，流式細(xì)胞術(shù)分析，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和液相芯片串珠測定[11]。其中MAPIPA測定具有高度的敏感性和特異性。

4.2 基因檢測

血小板基因分型才是血小板檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。HPA基因分型方法有序列特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)，變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)，限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)，高分辨率熔點(diǎn)曲線的方法(HRM)，HRM即通過確定DNA的熔點(diǎn)達(dá)到檢測目的。大多數(shù)情況下是通過替換C-G與A-T堿基對產(chǎn)生HPA多態(tài)性。HRM可以同時(shí)檢測1至4個(gè)多態(tài)性，這有利于確定稀有HPA的頻率[12]。另一種方法是熒光PCR反向序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)，使用熒光雜交探針可以同時(shí)確定幾個(gè)多態(tài)性[13]。

5 產(chǎn)前篩查

在通過妊娠檢查以MAIPA檢測同種抗體水平的研究中，隨著妊娠次數(shù)的增加抗體水平降低，產(chǎn)后6周檢測到最高水平的抗體。由于NAIT頻繁影響第一次懷孕，因此使得ICH經(jīng)常發(fā)生在產(chǎn)前，母體同種異體抗體對于預(yù)測胎兒的風(fēng)險(xiǎn)具有極大的價(jià)值。

同種異體抗體的特性和IgG的滴度可以有助于判斷癥狀的嚴(yán)重性?？贵w亞類的不同，補(bǔ)體活化能力，HPA抗體與吞噬細(xì)胞Fc受體結(jié)合的親和力也不同。已有數(shù)據(jù)分析HPA抗體免疫球蛋白的亞類[14]。雖然證據(jù)表明IgG2不如IgG1和 IgG3那樣有效的誘導(dǎo)吞噬和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，Kelsch指出IgG2能夠引起血小板功能障礙并導(dǎo)致臨床上顯著出血，即使血小板計(jì)數(shù)正常[15]。IgG的核心巖藻糖基化的調(diào)節(jié)可能對疾病嚴(yán)重程度，HPA同種抗體的抗體依賴的細(xì)胞毒性作用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[16]。

Kapur等人表示母體內(nèi)導(dǎo)致NAIT的HPA-1a抗原的特異性抗體，如果這種抗體缺乏核心巖藻糖，要比核心巖藻糖基化的抗體，吞噬已被抗體包被血小板作用更強(qiáng)[17]。Ferrara以及他的同事[18]，也發(fā)現(xiàn)了IgG分子的功能變化，缺乏核心巖藻糖殘基的IgG分子與FcgRIII的親和力更強(qiáng)，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞免疫功能，例如抗體依賴的細(xì)胞毒作用。研究顯示在NAIT的血清中，核心巖藻糖的降低程度與NAIT的嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。

6 展望

雖然NAIT是罕見的，但是它是良好狀態(tài)新生兒中患有嚴(yán)重血小板減少癥的最常見原因。由于人種不同HPA表型頻率不同，國外的數(shù)據(jù)無法指導(dǎo)我國的情況，因此為弄清我國孕婦孕期同種血小板抗體的產(chǎn)生情況以及新生兒NAIT的發(fā)病情況和ICH的風(fēng)險(xiǎn)，以便我們實(shí)施針對性的預(yù)防措施。任何患有血小板減少癥并且沒有其他確定原因的新生兒，或者曾經(jīng)生育過NAIT孩子的母親再次懷孕時(shí)，父母的血液樣本都應(yīng)該進(jìn)行NAIT測試。但是無論血清學(xué)方法還是基因檢測都存在一定的缺點(diǎn)，那么為了準(zhǔn)確的診斷NAIT，未來我們要不斷的完善檢測方法。如使用CHO和293T細(xì)胞，將編碼特異性HPA的cDNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)。使用含有七種罕見的HPA與整合素β3肽的重組體，稱為SuperRare的多肽類適合檢測抗HPA抗體。肽適體，模擬HPA-1a抗原，被HPA-1a同種異體抗體識別具有非常高的靈敏度[20]。多能干細(xì)胞編碼血小板表面糖蛋白基因的改變可以編碼血小板特異性同種抗原，并且這種抗原會(huì)有效表達(dá)[21]。新型的基因編輯技術(shù)，產(chǎn)生表達(dá)低頻的血小板特異性抗原的人類血小板的原始細(xì)胞。表達(dá)的蛋白與人類抗體相對應(yīng)。通過使用這種技術(shù)，創(chuàng)造血小板祖細(xì)胞或血小板表達(dá)的其他臨床上有顯著意義的抗原，目前正在進(jìn)行中。但是中國的NAIT的數(shù)據(jù)卻不足，而正在開展的孕婦抗-HPA抗體致新生兒同種免疫性血小板減少癥的多中心前瞻性隊(duì)列研究[22]，預(yù)計(jì)將在中國提供NAIT的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并篩查出能夠預(yù)測NAIT嚴(yán)重程度的具有中國特異性的抗體滴度。

作者簡介：劉鐵梅(1965-),女，博士，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，輸血科主任，主要從事臨床輸血工作。

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