王向東 張倩 褚立強(qiáng)

摘 要 利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)（ATRP）在硅片上合成聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）高分子刷，采用多次浸泡法在高分子刷中固定多層銀納米粒子（AgNP），形成POEGMA/AgNP復(fù)合SERS基底。掃描電鏡和紫外-可見吸收光譜分析表明，納米粒子成功固定到POEGMA高分子刷中并具有一定的三維排列。利用此SERS基底檢測(cè)了綠膿桿菌以及兩種代表性的QSSM分子（即綠膿素（PCN）和N-十二酰基高絲氨酸內(nèi)酯（C12-HSL））。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此SERS基底對(duì)PCN的檢出限為1010 mol/L，C12-HSL的檢出限為108 mol/L，綠膿桿菌的檢出限為10 CFU/mL。拉曼測(cè)試結(jié)果表明，POEGMA/AgNP納米復(fù)合SERS基底可以對(duì)綠膿桿菌和綠膿素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分。結(jié)合SERS技術(shù)的免標(biāo)記、高靈敏性以及受水干擾小等優(yōu)勢(shì)， POEGMA/AgNP納米復(fù)合SERS基底有望用于群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究。

關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼散射； 群體感應(yīng)； 綠膿桿菌； 綠膿素； 高分子刷； 銀納米粒子

1 引 言

診斷并抑制細(xì)菌感染對(duì)于醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、國土安全、食品加工和存儲(chǔ)等領(lǐng)域都至關(guān)重要。綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa， PAE）是一種常見的機(jī)會(huì)性致病菌，在傷口部位或人體免疫系統(tǒng)功能受損時(shí)，可引起急性和慢性感染，具有較高的致死率[1～3]。造成綠膿桿菌耐藥性強(qiáng)和難治愈的主要原因是綠膿桿菌極易形成生物膜，而生物膜的特殊結(jié)構(gòu)使其免受人體免疫系統(tǒng)和抗生素的攻擊[4～6]。研究表明，綠膿桿菌主要是通過群體感應(yīng)（Quorum sensing， QS）機(jī)制來調(diào)控生物膜的形成[7～9]。

群體感應(yīng)是指細(xì)菌之間通過分泌和感知特定的信號(hào)分子來進(jìn)行相互交流并調(diào)節(jié)自身生理行為的一種調(diào)控機(jī)制，可以使細(xì)菌群體更好地適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化[10～13]。簡(jiǎn)言之，細(xì)菌會(huì)分泌一種或多種低分子量的群體感應(yīng)信號(hào)分子（QSSM，又被稱為自誘導(dǎo)劑），當(dāng)菌體密度升高或QSSM濃度達(dá)到一定閾值后，細(xì)菌自身會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的一系列基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)細(xì)菌群體的行為。自從1994年群體感應(yīng)概念被提出以來，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的許多生理過程都由這種機(jī)制來調(diào)節(jié)，包括細(xì)菌分化、菌體發(fā)光現(xiàn)象、生物膜的形成和毒素分子的產(chǎn)生等[14～16]。

在綠膿桿菌的群體感應(yīng)機(jī)制研究過程中，研究者發(fā)現(xiàn)有多種信號(hào)分子可以調(diào)控細(xì)菌行為，最常見的一類信號(hào)分子是?；呓z氨酸內(nèi)酯化合物（Acyl-homoserine lactone， AHL），對(duì)于綠膿桿菌的毒性調(diào)控十分重要[17，18]。綠膿素（Pyocyanin ， PCN）也是綠膿桿菌產(chǎn)生的一種非常重要的群體感應(yīng)信號(hào)分子和毒素分子[19，20]， 可以抑制細(xì)胞呼吸功能和表皮細(xì)胞生長，引起環(huán)前列腺素釋放并破壞鈣穩(wěn)態(tài)[21，22]。迄今為止，已有多種分析技術(shù)被用于檢測(cè)QSSM，包括氣相色譜-質(zhì)譜法[23]、薄層色譜法[24]、高效液相色譜法[25， 26]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[27～29]、生物化驗(yàn)[30]、二維關(guān)聯(lián)能譜法等[31]。這些檢測(cè)技術(shù)通常成本較高，并且周期長。因此，開發(fā)一種不需要基因操作或標(biāo)記的方法用于QSSM的原位檢測(cè)十分必要。

表面增強(qiáng)拉曼散射光譜（SERS）作為一種超靈敏、免標(biāo)記、非侵入性的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可以通過獨(dú)特的指紋圖譜同時(shí)檢測(cè)多種不同分子，為生物分析和原位檢測(cè)提供了新的策略，近年來眾多研究者開始利用SERS技術(shù)檢測(cè)QSSM和各種細(xì)菌[32～37]。本研究以聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）高分子刷為基質(zhì)，利用多次浸泡法固定多層銀納米粒子（AgNP），制備了POEGMA/AgNP納米復(fù)合SERS基底。利用此基底檢測(cè)了綠膿桿菌以及兩種代表性的QSSM分子： 綠膿素和N-十二?；呓z氨酸內(nèi)酯（C12-HSL）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，POEGMA/AgNP復(fù)合SERS基底可以高靈敏地同時(shí)檢測(cè)綠膿桿菌和綠膿素。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

顯微拉曼光譜儀為實(shí)驗(yàn)室自主搭建，采用熱電冷卻 CCD 探測(cè)器（BTC 162E2-532H， 上海必達(dá)泰克光電科技有限公司）和532 nm固體激光器（MSL-FN-532， 功率為4 mW，長春新光電產(chǎn)業(yè)）； SU8000型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）； Cary100型紫外-可見分光光度計(jì)（美國安捷倫科技有限公司）； MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋（施都凱儀器設(shè)備上海有限公司）。

甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（OEGMA， Mn= ～360 g/mol）、三乙胺（99%）、2-溴代異丁酰溴（BIBB， 98%）檸檬酸鈉（99%）、KCl（99.8%）、Na2HPO4·12H2O（99%）、KH2PO4（99%）、綠膿素（優(yōu)級(jí)純）、N-十二?；呓z氨酸內(nèi)酯（C12-HSL， 分析純，Sigma-Aldrich公司）； 蛋白胨和酵母粉提取物（分析純， OXOID公司）； AgNO3（99%，天津德蘭精細(xì)化工有限公司）； 三氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%，西亞試劑有限公司）； CuBr（98%，北京百靈威科技有限公司）； 2，2′-聯(lián)吡啶（99%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）； PAK型綠膿桿菌（天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

綠膿素溶液的配制：將綠膿素溶于乙醇-超純水（1∶1， V/V）中，配制成5×104 mol/L，密封好置于冰箱中避光保存，后期使用時(shí)用超純水通過10倍稀釋法稀釋。N-十二?；呓z氨酸內(nèi)酯溶液的配制：將C12-HSL溶于色譜級(jí)甲醇溶液中，配制成濃度為1×103 mol/L的溶液，使用時(shí)用超純水通過10倍稀釋法稀釋。圖1為綠膿素和N-十二酰基高絲氨酸內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

2.2 高分子刷/銀納米粒子復(fù)合SERS基底的制備

本研究中所用SERS基底參照文獻(xiàn)[38]方法制備，其過程如圖2所示。首先在1 cm×1 cm單晶硅片上利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備POEGMA高分子刷，其干膜厚度約為48.6 nm。利用種子生長法制備直徑為25.8 nm的銀納米粒子。然后將POEGMA高分子刷浸泡在銀納米粒子溶液中，浸泡20 min后取出，用大量超純水沖洗基底，N2吹干。之后再將基底浸泡到銀納米粒子溶液中，如此重復(fù)18次，獲得具有多層銀納米粒子的復(fù)合SERS基底。

2.3 綠膿桿菌樣品的制備

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基的配制： 用超純水配制1%（w/w）蛋白胨、1%（w/w）NaCl、0.5%（w/w）酵母提取物的混合溶液，用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.3。磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制： 分別稱取Na2HPO4·12H2O（3.628 g）、 KH2PO4（0.24 g）、 NaCl（8 g）和KCl（0.2 g），溶于800 mL水中，調(diào)節(jié)至pH 7.4， 超純水定容至1000 mL。將上述配制好的LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液及容器等全部于121℃高壓滅菌20 min。

接種細(xì)菌：在200 mL LB培養(yǎng)基中加入10 μL菌種，于恒溫?fù)u床中37℃培養(yǎng)20 h（180 r/min）。菌種為PAK型的綠膿桿菌，儲(chǔ)存在甘油管中置于冰箱冷凍。PBS稀釋菌液：用紫外-可見分光光度儀定波長掃描（波長為600 nm）檢測(cè)菌液的OD值，確定菌液的初始的OD值，4000 r/min離心5 min ，棄上清液，用PBS緩沖液將離心后的細(xì)菌稀釋至OD=0.5，此時(shí)細(xì)菌濃度約為4×108 CFU/mL[39，40]，然后采用10倍稀釋法用PBS稀釋菌液，使菌液達(dá)到相應(yīng)濃度。

2.4 拉曼光譜檢測(cè)

室溫下，將100 μL QSSM溶液（即PCN或C12-HSL）滴在SERS基底表面，待溶液蒸發(fā)干后采集SERS光譜。綠膿桿菌SERS光譜的采集：將SERS基底放置于菌液中，在搖床上搖動(dòng)2 h（80 r/min），然后取出進(jìn)行拉曼檢測(cè)。SERS光譜采集參數(shù)如下：拉曼位移范圍200～3500 cm1，積分時(shí)間50 s。每個(gè)樣品選不同位置，重復(fù)測(cè)量5次。

3 結(jié)果與討論

3.1 高分子刷/銀納米粒子復(fù)合SERS基底的表征

圖3A是經(jīng)過18次浸泡后獲得的復(fù)合SERS基底的SEM圖，可以看出銀納米粒子分布均勻。圖3A中有一些比較暗的納米粒子，顯示銀納米粒子具有一定的三維分布，此結(jié)果說明多次浸泡的方法可以促進(jìn)銀納米粒子在POEGMA高分子刷中的固定。利用ImageJ軟件對(duì)圖3A中納米粒子的粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其粒徑分布圖如圖3B所示，銀納米粒子的粒徑為（30.3±7.2） nm。圖3C為制備好SERS基底的UV-Vis吸收光譜圖，此實(shí)驗(yàn)過程中將硅片換成了石英玻璃片。如圖3C所示，單純POEGMA高分子刷基底沒有出現(xiàn)任何吸收峰，而當(dāng)浸泡18次后，復(fù)合SERS基底在425 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰，表明經(jīng)過18次重復(fù)浸泡后，基底上已經(jīng)固定大量的銀納米粒子。此結(jié)果與本研究組之前的研究結(jié)果基本一致[38]，說明采用多次浸泡法可以方便地制備含有多層銀納米粒子的復(fù)合SERS基底。當(dāng)銀納米粒子分布均勻且相距較近時(shí)，銀納米粒子之間可發(fā)生電感耦合產(chǎn)生電磁場(chǎng)增強(qiáng)，形成SERS“熱點(diǎn)”[41]。

3.2 綠膿素和N-十二酰基高絲氨酸內(nèi)酯的SERS檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[42～44]，對(duì)于群體感應(yīng)信號(hào)分子PCN和C12-HSL，以及綠膿桿菌的拉曼光譜峰的歸屬見表1。 不同濃度的PCN和C12-HSL溶液的SERS光譜圖見圖4A和4C。圖4A中， 427、550、617、1352和1560 cm1處拉曼峰為PCN的特征峰，并且峰強(qiáng)度隨濃度增大而增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)[36，43，44]相符。對(duì)1352 cm1處的拉曼峰進(jìn)行積分， 表示PCN檢測(cè)強(qiáng)度（圖4B）。綜合圖4A和4B可知，SERS基底對(duì)PCN的檢測(cè)極限為1010 mol/L，并且可實(shí)現(xiàn)對(duì)PCN的半定量分析。在圖4C中，606、1364和1646 cm1處拉曼峰為C12-HSL的特征峰，其強(qiáng)度隨濃度增大而增強(qiáng)。對(duì)1646 cm1處的拉曼峰積分用于表示C12-HSL檢測(cè)強(qiáng)度，如圖4D所示。綜合圖4C和4D可知，SERS基底對(duì)C12-HSL的檢出限為108 mol/L，但檢測(cè)信號(hào)誤差較大。C12-HSL的檢出極限比PCN的差，這是因?yàn)閹в泄曹椊Y(jié)構(gòu)的PCN分子的SERS效應(yīng)更強(qiáng)[45]。 生物體系中QSSM分子的相關(guān)濃度范圍是106～109 mol/L[36，46]，本研究制備的SERS基底檢測(cè)的PCN和C12-HSL的濃度范圍符合生物學(xué)檢測(cè)要求。因此，有望利用SERS基底在細(xì)菌生成生物膜之前檢測(cè)QSSM分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌生物信號(hào)分子的干預(yù)并抑制生物膜的形成。

3.3 綠膿桿菌的SERS檢測(cè)

圖5A是不同濃度綠膿桿菌的SERS光譜圖。664、720和1493 cm1等吸收峰為綠膿桿菌的拉曼特征峰，峰的強(qiáng)度隨細(xì)菌濃度增大而增強(qiáng)。在綠膿桿菌的SERS光譜中，在412、604、1352 cm1處也出現(xiàn)了峰，均為PCN的特征峰， 這是因?yàn)樵诰G膿桿菌生長過程中會(huì)分泌PCN。選用 1493 cm1處的拉曼峰積分用來表示綠膿桿菌檢測(cè)強(qiáng)度，結(jié)果如圖5B所示，SESR基底可以檢測(cè)綠膿桿菌的濃度范圍為10～104 CFU/mL， 檢出限為10 CFU/mL，因此可對(duì)綠膿桿菌進(jìn)行半定量分析。

3.4 綠膿桿菌和綠膿素SERS譜圖對(duì)比分析

將POEGMA/AgNP復(fù)合基底用于綠膿桿菌和綠膿素混合樣品的檢測(cè)。

圖6b和6c是單獨(dú)測(cè)量綠膿素和綠膿桿菌時(shí)獲得的SERS譜圖，其中綠膿素和綠膿桿菌的樣品處理和測(cè)試過程保持一致。對(duì)比圖6b和6c可知，綠膿桿菌和綠膿素雖然存在一些重合的峰，但是由于綠膿桿菌會(huì)出現(xiàn)不同的特征峰，因此本研究中制備的復(fù)合SERS基底可以區(qū)分綠膿素與綠膿桿菌。圖6d是將1×105 mol/L綠膿素和4×104 CFU/mL綠膿桿菌混合后測(cè)量的拉曼譜圖?？梢娀旌蠘悠凡糠掷宓奈恢脮?huì)發(fā)生改變，如1493 cm1處的峰會(huì)移至1523 cm1，664 cm1處的峰會(huì)被遮擋，但是仍可以觀察到綠膿桿菌和綠膿素各自的特征峰。該結(jié)果表明，用SERS基底區(qū)分混合液中的綠膿桿菌和綠膿素是可行的。這為在綠膿桿菌溶液中原位檢測(cè)綠膿素，并進(jìn)一步研究群體感應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

利用POEGMA聚合物刷與銀納米粒子構(gòu)建的SERS基底可以檢測(cè)并區(qū)分兩種生物信號(hào)分子：綠膿素和N-十二?；呓z氨酸內(nèi)酯，檢出限分別為1010 mol/L和108 mol/L，在生物學(xué)QSSM的相關(guān)濃度范圍內(nèi)， 基底對(duì)綠膿桿菌的檢出限為10 CFU/mL，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)綠膿桿菌和綠膿素的區(qū)分和鑒別。SERS基底的高靈敏性和指紋識(shí)別能力，為群體感應(yīng)信號(hào)分子在生物體系中的原位檢測(cè)提供了新思路，為群體感應(yīng)體系的研究提供了新方法。

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