郭芳蕓，蔣 倩，楊永花，孫 璐，周 銘，劉成富

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州市園林科學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730070)

蔣倩為通訊作者。

觀賞海棠(Malusspp.)為薔薇科蘋果屬灌木或小喬木，是中國(guó)的傳統(tǒng)名花之一，其姿態(tài)瀟灑，花開(kāi)似錦，具有適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒、耐旱的特性，常作為城市綠化、美化的觀賞花木，在園林植物造景配置中可叢植或群植，觀賞價(jià)值極高，綠化效果出眾，應(yīng)用范圍極為廣泛[1]。

觀賞海棠的抗寒性研究已有報(bào)道[2]，韓玲玲等[3]對(duì)內(nèi)蒙古包頭市引種的紅寶石、珍珠、亞當(dāng)、西府海棠、鉆石等觀賞海棠的抗寒性研究表明，抗寒性強(qiáng)弱依次為紅寶石>珍珠>亞當(dāng)>西府海棠>鉆石；李萍萍[4]對(duì)山東省15個(gè)觀賞海棠品種的抗寒性研究顯示，各品種的抗寒性強(qiáng)弱有較大差異。蘭州地處西北內(nèi)陸，冬季漫長(zhǎng)且較寒冷，雨雪少，因此，低溫凍害是影響園林植物生長(zhǎng)與分布的重要因素之一[5]。為此，通過(guò)對(duì)凱爾斯、雪球、火焰、草莓果凍、紅麗、絢麗6種觀賞海棠在不同低溫脅迫下的電導(dǎo)率、可溶性糖、脯氨酸等相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，運(yùn)用綜合評(píng)價(jià)方法，研究其在蘭州地區(qū)的抗寒性表現(xiàn)，旨在為選用本地耐寒性觀賞海棠品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為蘭州市園林科研所提供的6個(gè)觀賞海棠品種凱爾斯(Kelsey)、雪球(Snowdrift)、火焰(Flame)、草莓果凍(Strawberry Parfait)、紅麗(Red Splendor)、絢麗(Radiant)的一年生枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣和材料處理 選取栽培管理?xiàng)l件基本相同的6個(gè)觀賞海棠品種一年生枝條，各品種按照對(duì)角線法選取長(zhǎng)勢(shì)相近的5株，從每株上隨機(jī)采5條一年生枝條，要求枝條充分成熟，粗度相近，整齊均勻，從枝條基部第3個(gè)芽處剪留長(zhǎng)度為10 cm枝條,供試枝條先用自來(lái)水和去離子水洗滌晾干后，將任意選取的6個(gè)觀賞海棠枝條用塑料薄膜紙裝袋，置于超低溫冰箱中進(jìn)行人工冷凍脅迫，脅迫溫度分別為0、-5、-10、-15、-20及-25℃，每級(jí)溫度處理10 h，將冷凍過(guò)的枝條置于4℃冰箱解凍2.5 h取出，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)品種的每種處理重復(fù)測(cè)3次。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 6個(gè)觀賞海棠品種的耐寒性指標(biāo)測(cè)定，電導(dǎo)率采用雷磁電導(dǎo)儀測(cè)定[6]，計(jì)算電解質(zhì)滲出率及半致死溫度，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[6]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[6]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定[6]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT顯色法測(cè)定[7]，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[7]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定[7]。

1.2.3 半致死溫度確定 將所測(cè)得的相對(duì)電導(dǎo)率與處理溫度配合成logistic方程[8]，求出該曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)時(shí)的溫度，以此作為植物組織的低溫脅迫半致死溫度(LT50),相對(duì)電導(dǎo)率擬合成logistic回歸方程：

Y=K/(1+ae-bx)

(1)

LT50= -lna/b

(2)

式中：K為曲線的漸近線，即最大電解質(zhì)滲出率，LT50是曲線的拐點(diǎn)溫度。Y為細(xì)胞傷害率，x為處理溫度，K為細(xì)胞傷害率的飽和容量，a、b是以處理溫度為自變量，以ln{(k-y)/y}為因變量的線性方程系數(shù)。

1.2.4 抗寒性綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定值，應(yīng)用隸屬函數(shù)法進(jìn)行計(jì)算并綜合評(píng)價(jià)，此次試驗(yàn)中相對(duì)電導(dǎo)率和MDA與抗寒性成負(fù)相關(guān)，故采用方程：

X(μ)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、SOD、POD活性與抗寒性成正相關(guān)，故用方程：

X(μ)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

式中：Xij為各指標(biāo)測(cè)定值，Xmax為不同梯度低溫處理下各指標(biāo)的最大值，Xmin為各指標(biāo)的最小值，累加各指標(biāo)的X(μ)，求出平均值，平均值越大，抗寒性越強(qiáng)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用Microsoft office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)并作圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行隸屬函數(shù)計(jì)算及l(fā)ogistic方程擬合、方差分析等。采用系統(tǒng)聚類法對(duì)6個(gè)品種的抗寒性進(jìn)行聚類，運(yùn)用皮爾遜法進(jìn)行半致死溫度(LT50)的求解，并對(duì)7個(gè)生理指標(biāo)變化進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)枝條相對(duì)電導(dǎo)率的影響

隨著處理溫度降低，6個(gè)觀賞海棠品種的相對(duì)電導(dǎo)率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，-10℃之前，相對(duì)電導(dǎo)率緩慢上升，-10℃之后，各品種相對(duì)電導(dǎo)率均上升明顯；-15～-20℃，雪球相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)26.17%，居首位，草莓果凍增長(zhǎng)22.48%，僅次雪球，凱爾斯增長(zhǎng)17.91%，絢麗、紅麗、火焰增長(zhǎng)均趨于緩慢。至-25℃時(shí)，各相對(duì)電導(dǎo)率值，草莓果凍>雪球>紅麗>凱爾斯>火焰>絢麗,-20～-25℃，草莓果凍、雪球與其他品種間相對(duì)電導(dǎo)率差異顯著，且值明顯高于其他品種，說(shuō)明草莓果凍、雪球耐寒性遠(yuǎn)低于其他品種(圖1)。

圖1 低溫處理下枝條的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.1 The relative conductivity of ornamental crabapple under low temperature stress注：圖中相同溫度下不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 低溫脅迫對(duì)枝條MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，這種氧化會(huì)對(duì)細(xì)胞造成大的損傷，作為細(xì)胞毒害物質(zhì)，其含量積累越多，表明其抗寒力越弱[9]。

隨著處理溫度降低,各品種海棠MDA含量呈上升趨勢(shì)，-5℃時(shí)，凱爾斯MDA含量最高，之后趨于緩和，-15～-20℃時(shí)，絢麗增長(zhǎng)92.27%，凱爾斯增長(zhǎng)58.65%，紅麗增長(zhǎng)24.42%，-20℃下，絢麗、紅麗、火焰、雪球含量均達(dá)到最大值，-20～-25℃，草莓果凍含量持續(xù)上升，其余品種含量均下降，-25℃時(shí)，各品種含量：紅麗>絢麗>草莓果凍>凱爾斯>雪球>火焰，方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫脅迫下各品種觀賞海棠MDA含量差異顯著，故可以用MDA為單一指標(biāo)評(píng)價(jià)幾種海棠的耐寒性強(qiáng)弱(圖2)。

2.3 低溫脅迫對(duì)枝條可溶性糖含量的影響

為抵御低溫，植物細(xì)胞可將蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，以增加細(xì)胞液濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓平衡，降低水勢(shì)及冰點(diǎn)，提高其抗寒力。溫度不斷降低時(shí)，各品種海棠含糖量呈現(xiàn)低—高—低的增長(zhǎng)趨勢(shì)；0℃下，凱爾斯與其他品種差異顯著，-5～-10℃，凱爾斯與草莓果凍的增長(zhǎng)率達(dá)43.68%及33.34%,凱爾斯增長(zhǎng)居于首位，-10℃時(shí)，草莓果凍含糖量達(dá)最高，之后迅速下降又回升，-25℃時(shí)仍高于0℃含量，-10～-15℃，草莓果凍的含糖量降低42.45%，其余品種均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，-15～-25℃，火焰增長(zhǎng)9.2%，紅麗增長(zhǎng)12.50%，雪球增長(zhǎng)15.66%，-25℃下，可溶性糖含量大小為：凱爾斯>雪球>絢麗>火焰>草莓果凍>紅麗(圖3)。

圖2 低溫處理下枝條MDA的含量Fig.2 The MDA concentration of ornamental crabapple under low temperature stress

圖3 低溫處理下枝條可溶性糖的含量Fig.3 The sugar content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.4 低溫脅迫對(duì)枝條可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白可作為細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御低溫，從而保護(hù)植物組織免受低溫傷害[11]。溫度持續(xù)下降時(shí)，可溶性蛋白含量總體呈高—低—高的增長(zhǎng)趨勢(shì)，各觀賞海棠品種蛋白質(zhì)含量在61.525～79.828 mg/g；0～-10℃，其含量緩慢上升，-10～-15℃，可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì)，-15℃時(shí)，出現(xiàn)最低值，-20℃時(shí)，其值明顯上升，火焰增長(zhǎng)4.72%，紅麗增長(zhǎng)15.08%，凱爾斯增長(zhǎng)17.91%，草莓果凍增長(zhǎng)16.69%，絢麗增長(zhǎng)達(dá)22.57%，增速最大；至-25℃時(shí)，各品種含量：雪球>火焰>絢麗>紅麗>草莓果凍>凱爾斯，且品種間可溶性蛋白含量差異不顯著(圖4)。

圖4 低溫處理下枝條可溶性蛋白的含量Fig.4 The soluble protein content of ornamental crabapple under low temperature stresss

2.5 低溫脅迫對(duì)枝條脯氨酸含量的影響

脯氨酸作為植物蛋白的主要成分之一，以游離態(tài)存在于植物細(xì)胞中，可用于合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，其含量與抗寒性密切相關(guān)[12]。

隨著溫度不斷降低，脯氨酸含量總體呈低—高—低的“M”波動(dòng)狀態(tài)，-5～-10℃，凱爾斯下降70.41%，草莓果凍下降58.70%，雪球下降50.08%，火焰下降75.63%，絢麗下降64.56%，-20～-25℃，脯氨酸含量迅速上升，紅麗增長(zhǎng)104.39%，火焰增長(zhǎng)174.47%，雪球增長(zhǎng)173.35%，草莓果凍增長(zhǎng)211.76%，其中草莓果凍增速最大，-25℃時(shí)其在絢麗的含量低于0℃含量，且絢麗與其他品種間差異顯著(圖5)。

圖5 低溫處理下枝條脯氨酸的含量Fig.5 The proline content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.6 低溫脅迫對(duì)枝條SOD酶含量的影響

低溫初期(0～-5℃)，除絢麗以外，海棠各品種SOD酶含量均有所上升，其中凱爾斯增幅最大，達(dá)82.72%，火焰次之，達(dá)39.35%；-5℃下，凱爾斯與火焰SOD酶含量出現(xiàn)峰值，-10～-15℃，除凱爾斯外，各品種SOD含量呈上升趨勢(shì)，-15℃下，草莓果凍、火焰、雪球與絢麗、紅麗、凱爾斯間差異顯著，-15～-20℃，雪球、凱爾斯、絢麗、火焰均呈下降趨勢(shì)，且降幅明顯；-20～-25℃，各品種含量均迅速增長(zhǎng)，絢麗增長(zhǎng)3.11倍，凱爾斯增長(zhǎng)0.71倍，雪球增長(zhǎng)0.44倍，草莓果凍增長(zhǎng)0.07倍，其值最小。至-25℃時(shí)，SOD酶活性為草莓果凍>凱爾斯>火焰>紅麗>絢麗>雪球(圖6)。

圖6 低溫處理下枝條SOD酶的含量Fig.6 The SOD content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.7 低溫脅迫對(duì)POD酶含量的影響

POD是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)H2O2的主要酶類，起酶促降解的作用，可催化H2O2轉(zhuǎn)化為活性較低的H2O和O2，從而達(dá)到保護(hù)植物細(xì)胞膜的作用，其活性與抗寒性密切相關(guān)[14]。

0～-10℃，紅麗、絢麗、草莓果凍的POD酶活性均無(wú)明顯變化，凱爾斯先升后降，火焰、雪球先降后升，但變化幅度均不明顯,-10～-15℃，除雪球外，其余品種均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；-15～-20℃時(shí)，各品種POD酶活性均迅速下降，出現(xiàn)最低值，-25℃時(shí)迅速上升，增幅為紅麗10.05倍，草莓果凍8.54倍，凱爾斯3.20倍，紅麗增長(zhǎng)居于首位，凱爾斯居最后，這是植物響應(yīng)低溫脅迫的保護(hù)性反應(yīng)，抑制植物細(xì)胞在低溫脅迫下過(guò)氧化作用進(jìn)一步加深。至-25℃，除火焰外，各含量均出現(xiàn)峰值，大小順序?yàn)椋簞P爾斯>紅麗>雪球>絢麗>火焰>草莓果凍，品種間POD酶活性差異顯著(圖7)。

圖7 低溫處理下枝條POD酶的含量Fig.7 The POD content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.8 低溫脅迫下枝條半致死溫度的確定

利用不同溫度下各觀賞海棠品種的相對(duì)電導(dǎo)率值擬合非線性logistic方程，求得6個(gè)觀賞海棠枝條的半致死溫度(表1)。

將表1所示的數(shù)據(jù)，以不同溫度和相對(duì)電導(dǎo)率為參數(shù)進(jìn)行Logistic方程非線性擬合，得到6個(gè)品種觀賞海棠Logistic方程及半致死溫度，所有方程擬合度均大于0.9，達(dá)到極顯著水平。半致死溫度越低，其抗寒性越強(qiáng)，其中凱爾斯的半致死溫度遠(yuǎn)低于其他品種，達(dá)到-24.91℃；紅麗、絢麗、火焰的半致死溫度居中，均在-20～-22℃；而雪球、草莓果凍的半致死溫度最高，均在-20℃以上。

表1 供試枝條的logistic方程及半致死溫度

注：擬合度R2均達(dá)極顯著水平

2.9 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

以上7種指標(biāo)測(cè)定6個(gè)觀賞海棠品種抗寒性強(qiáng)弱差異各有不同，且有研究表明，低溫脅迫下，植物的抗性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理、生化、生態(tài)過(guò)程[15]。并且各種生理指標(biāo)間相互影響、相互作用，單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抗寒性強(qiáng)弱,故采用兩種方法進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)。

2.9.1 抗寒性聚類分析 將6個(gè)觀賞海棠的枝條不同低溫處理后，測(cè)定各指標(biāo)，選取-25℃下各指標(biāo)的測(cè)定值，進(jìn)行聚類，在相似系數(shù)為5的水平上，可將6個(gè)

觀賞海棠的耐寒力分為3類，耐寒力最強(qiáng)為凱爾斯，耐寒力次之為絢麗，耐寒力較弱為草莓果凍、雪球、紅麗、火焰(圖8)。

圖8 6個(gè)觀賞海棠品種的抗寒性聚類分析Fig.8 Cluster analysis of six ornamental crabapple varieties to low temperature stress

2.9.2 隸屬函數(shù)分析法 綜合評(píng)價(jià)6個(gè)觀賞海棠的抗寒性強(qiáng)弱，對(duì)各級(jí)低溫處理下的枝條測(cè)定指標(biāo)后，將各指標(biāo)測(cè)定值用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換(表2)。

表2 6個(gè)觀賞海棠品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)

注：1.可溶性糖；2.可溶性蛋白；3.SOD酶活性；4.POD酶活性；5.脯氨酸；6.丙二醛；7.相對(duì)電導(dǎo)率；Zij平均隸屬度

2.9.3 抗寒性各指標(biāo)間的相關(guān)性 從試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析，各指標(biāo)含量變化差異較大，為進(jìn)一步明確各指標(biāo)間的抗寒作用過(guò)程及觀賞海棠耐寒性機(jī)制，研究植物亞細(xì)胞受凍機(jī)理[16]，對(duì)耐寒性指標(biāo)作相關(guān)性計(jì)算(表3)。

在0.05水平上，可溶性糖與相對(duì)電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)、與MDA呈極顯著負(fù)相關(guān)；可溶性蛋白與脯氨酸呈顯著正相關(guān)；POD酶活性與可溶性蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)，SOD酶與可溶性糖呈顯著正相關(guān)(表3)。

表3 影響觀賞海棠抗寒性各指標(biāo)間的相關(guān)性系數(shù)矩陣

注：*表示在0.05 水平(單側(cè))上顯著相關(guān)；**表示在0.01 水平(單側(cè))上顯著相關(guān)

3 討論

隨著脅迫溫度不斷降低，觀賞海棠各品種相對(duì)電導(dǎo)率值不斷上升，且相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)上升的實(shí)質(zhì)是植物細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重，抗寒性越弱。MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，先上升至-20℃時(shí)再下降，作為細(xì)胞膜脂發(fā)生過(guò)氧化的毒害產(chǎn)物，MDA可與蛋白質(zhì)結(jié)合，引起膜蛋白的變性，致使質(zhì)膜流動(dòng)性降低、代謝生理紊亂，細(xì)胞膜活性下降，其含量升高與相對(duì)電導(dǎo)率升高表征結(jié)果一致，植物受低溫凍害，細(xì)胞膜透性不斷增大，產(chǎn)生阻礙細(xì)胞正常生活的物質(zhì)更多。MDA含量迅速下降，可能是SOD、可溶性糖、脯氨酸等起作用，抑制了MDA的合成[17]。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)低溫逆境的一種主要方式，可溶性糖、可溶性蛋白等作為調(diào)節(jié)因子，可增大細(xì)胞膨壓，提高束縛水含量，防止因細(xì)胞過(guò)度失水，植物萎焉而死。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可溶性糖總體為上升趨勢(shì)，且有輕微波動(dòng)狀態(tài)，海棠耐寒性越強(qiáng)，其含糖量越高，含量增幅越明顯。-10～-15℃，草莓果凍含糖量迅速下降39.6%，可能是由于其抗寒性較弱，在此溫度期間，脅迫溫度接近冰點(diǎn)溫度，需消耗自身熱量，維持正常生理活動(dòng)引起的反應(yīng)機(jī)制[18]；脯氨酸測(cè)定結(jié)果顯示，海棠抗寒性越弱，其含量積累越多，增幅越大，反之，越小。這與劉娥娥[19]等研究結(jié)果一致，說(shuō)明低溫脅迫下，植物組織可積極調(diào)動(dòng)脯氨酸等內(nèi)源物質(zhì)來(lái)抵御凍害；在低溫變化過(guò)程中，可溶性蛋白含量總體變化幅度不大，至-15℃時(shí)，含量迅速下降，可能是低溫限制了與合成蛋白質(zhì)相關(guān)的酶活性，致使其含量合成受阻。

SOD、POD是植物逆境下的抗氧化酶系統(tǒng)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SOD酶活性短暫升高后又下降，之后持續(xù)保持在較穩(wěn)定狀態(tài)，SOD酶活性下降，可能是MDA含量增加，抑制了其活性變化，之后由于可溶性糖等含量上升，調(diào)節(jié)了細(xì)胞滲透壓，使得MDA含量下降，SOD 恢復(fù)自身活性；研究結(jié)果顯示，脯氨酸與可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明脯氨酸有利于蛋白質(zhì)的合成與積累，利于抵御低溫脅迫；可溶性糖與相對(duì)電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)，與MDA呈顯著負(fù)相關(guān)，這與前人研究結(jié)果一致[20-22]，一定時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞遭受低溫脅迫，膜透性增強(qiáng)，可溶性糖含量升高，以增加細(xì)胞滲透壓防止內(nèi)含物外滲，延緩相對(duì)電導(dǎo)率上升速度，此時(shí)，膜的過(guò)氧化程度較低，MDA積累較少，當(dāng)脅迫溫度接近冰點(diǎn)溫度時(shí)，細(xì)胞有害物質(zhì)MDA大量產(chǎn)生，相對(duì)電導(dǎo)率迅速上升。

4 結(jié)論

6個(gè)觀賞海棠品種一年生枝條通過(guò)不同梯度低溫脅迫，其相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及SOD等的含量均有所上升；通過(guò)應(yīng)用logistic方程，聚類分析、隸屬函數(shù)等綜合性評(píng)價(jià)方法，得出6個(gè)觀賞海棠品種的耐寒性強(qiáng)弱依次為凱爾斯>紅麗>絢麗>火焰>雪球>草莓果凍。

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